Nekontrolovateľne narastajúce podávanie konvenčných antibiotík viedlo k vzniku rezistencie mikroorganizmov voči nim a podnietilo hľadanie ich nových potenciálných alternatív, ktorými môžu byť okrem iného i antimikrobiálne peptidy. LL-37 je jediným ľudským antimikrobiálnym peptidom z rodiny katelicidínov, ktorý vykazuje širokospektrálnu antimikrobiálnu aktivitu voči grampozitívnym a gramnegatívnym baktériám, vírusom či hubovým organizmom.
Táto práca sa zaoberá izoláciou LL-37 fúzovaného s maltózu viažúcim proteínom (MBP_rhLL-37) z transgénného jačmeňa Hordeum vulgare, kultivar Golden Promise. Za týmto účelom bol optimalizovaný spôsob extrakcie a purifikácie MBP_rhLL-37 z lyofilizovaného prášku zŕn jačmeňa v štádiu neskorej mliečnej zrelosti zŕn. Efektivita a výťažnosť zvolených metód prečistenia (afinitná chromatografia a precipitácia proteínov v prítomnosti vysokej koncentrácie soli) bola vyhodnotená pomocou elektroforetickej separácie v polyakrylamidovom géli a následnou imunodetekciou za použitia špecifickej primárnej protilátky voči LL-37. Na základe získaných dát je možné za najvhodnejšiu metódu purifikácie považovať precipitáciu proteínov síranom amónnym.
Anotace v angličtině
Uncontrollably increasing usage of conventional antibiotics led to the emergence of microbial resistance to them and caused search for their new potential alternatives, which can be, among others, also antimicrobial peptides. LL-37 is the only human antimicrobial peptide from the cathelicidin family that exhibits broad-spectrum antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria, viruses, and fungal organisms.
This work deals with the isolation of LL-37 fused to maltose binding protein (MBP_rhLL-37) from transgenic barley Hordeum vulgare, cultivar Golden Promise. For this purpose, the method of extraction and purification of MBP_rhLL-37 from the lyophilized powder of barley grains at the stage of late milk maturity of the grains was optimized. The efficiency and yield of the selected purification methods (affinity chromatography and precipitation of proteins in the presence of a high concentration of salt) was evaluated using electrophoretic separation in polyacrylamide gel and subsequent immunodetection using a specific primary antibody against LL-37. Based on the obtained data, it is possible to consider precipitation of proteins with ammonium sulfate as the most effective method of purification.
Nekontrolovateľne narastajúce podávanie konvenčných antibiotík viedlo k vzniku rezistencie mikroorganizmov voči nim a podnietilo hľadanie ich nových potenciálných alternatív, ktorými môžu byť okrem iného i antimikrobiálne peptidy. LL-37 je jediným ľudským antimikrobiálnym peptidom z rodiny katelicidínov, ktorý vykazuje širokospektrálnu antimikrobiálnu aktivitu voči grampozitívnym a gramnegatívnym baktériám, vírusom či hubovým organizmom.
Táto práca sa zaoberá izoláciou LL-37 fúzovaného s maltózu viažúcim proteínom (MBP_rhLL-37) z transgénného jačmeňa Hordeum vulgare, kultivar Golden Promise. Za týmto účelom bol optimalizovaný spôsob extrakcie a purifikácie MBP_rhLL-37 z lyofilizovaného prášku zŕn jačmeňa v štádiu neskorej mliečnej zrelosti zŕn. Efektivita a výťažnosť zvolených metód prečistenia (afinitná chromatografia a precipitácia proteínov v prítomnosti vysokej koncentrácie soli) bola vyhodnotená pomocou elektroforetickej separácie v polyakrylamidovom géli a následnou imunodetekciou za použitia špecifickej primárnej protilátky voči LL-37. Na základe získaných dát je možné za najvhodnejšiu metódu purifikácie považovať precipitáciu proteínov síranom amónnym.
Anotace v angličtině
Uncontrollably increasing usage of conventional antibiotics led to the emergence of microbial resistance to them and caused search for their new potential alternatives, which can be, among others, also antimicrobial peptides. LL-37 is the only human antimicrobial peptide from the cathelicidin family that exhibits broad-spectrum antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria, viruses, and fungal organisms.
This work deals with the isolation of LL-37 fused to maltose binding protein (MBP_rhLL-37) from transgenic barley Hordeum vulgare, cultivar Golden Promise. For this purpose, the method of extraction and purification of MBP_rhLL-37 from the lyophilized powder of barley grains at the stage of late milk maturity of the grains was optimized. The efficiency and yield of the selected purification methods (affinity chromatography and precipitation of proteins in the presence of a high concentration of salt) was evaluated using electrophoretic separation in polyacrylamide gel and subsequent immunodetection using a specific primary antibody against LL-37. Based on the obtained data, it is possible to consider precipitation of proteins with ammonium sulfate as the most effective method of purification.
V posledních desetiletích se rozšířilo podávání konvenčních antibiotik což vedlo ke značnému nárůstu mikrobů odolných vůči léčivům. Antimikrobiální peptidy (AMP) představují nové potenciální alternativy k antibiotikům nakolik jsou součástí vrozeného imunitního systému u savců a vykazují široké spektrum antibakteriálních vlastnosti. LL-37 je malý peptid odvozen od jediného známého člena rodiny lidských katelicidinů, které se kromě jiného aktivně podílí na různých fyziologických reakcích v eukaryotických buňkách. Jeho přítomnost byla detekovaná v různých buňkách a tkáních, jako jsou cirkulující neutrofily, myeloidní buňky kostní dřeně, epiteliální buňky kůže a tkáně v gastrointestinálním traktu. Proto je v poslední době kladen důraz na velkoobjemovou a levnou produkci rekombinantních AMP, jako je LL-37, bez přítomnosti mikrobiálních endotoxinů pro farmaceutické aplikace.
Cílem této práce bude extrahovat lidský antimikrobiální peptid LL-37 z lyofilizovaných zrn ječmene ve stádiu mléčné zralosti. Následně bude peptid pročištěn za použití nízkotlaké kapalinové chromatografie a charakterizován za různých teplotních podmínek. Verifikace purifikace a stability proběhne imunodetekcí se specifickou primární protilátkou rozeznávající proteolytický fragment LL-37 CAP18 prekurzoru.
Zásady pro vypracování
V posledních desetiletích se rozšířilo podávání konvenčních antibiotik což vedlo ke značnému nárůstu mikrobů odolných vůči léčivům. Antimikrobiální peptidy (AMP) představují nové potenciální alternativy k antibiotikům nakolik jsou součástí vrozeného imunitního systému u savců a vykazují široké spektrum antibakteriálních vlastnosti. LL-37 je malý peptid odvozen od jediného známého člena rodiny lidských katelicidinů, které se kromě jiného aktivně podílí na různých fyziologických reakcích v eukaryotických buňkách. Jeho přítomnost byla detekovaná v různých buňkách a tkáních, jako jsou cirkulující neutrofily, myeloidní buňky kostní dřeně, epiteliální buňky kůže a tkáně v gastrointestinálním traktu. Proto je v poslední době kladen důraz na velkoobjemovou a levnou produkci rekombinantních AMP, jako je LL-37, bez přítomnosti mikrobiálních endotoxinů pro farmaceutické aplikace.
Cílem této práce bude extrahovat lidský antimikrobiální peptid LL-37 z lyofilizovaných zrn ječmene ve stádiu mléčné zralosti. Následně bude peptid pročištěn za použití nízkotlaké kapalinové chromatografie a charakterizován za různých teplotních podmínek. Verifikace purifikace a stability proběhne imunodetekcí se specifickou primární protilátkou rozeznávající proteolytický fragment LL-37 CAP18 prekurzoru.
Seznam doporučené literatury
1) Holaskova E. et al. (2015) Antimicrobial peptide production and plant-based expression systems for medical and agricultural biotechnology. Biotech Adv 33, 1005–1023.
2) Holaskova E. et al. (2018) Molecular Farming in Barley: Development of a Novel Production Platform to Produce Human Antimicrobial Peptide LL-37. Biotechnol J 13, 1700628 (1-10).
3) Mirzaee M. et al. (2021) Long-Lasting Stable Expression of Human LL-37 Antimicrobial Peptide in Transgenic Barley Plants. Antibiotics 10, 898.
4) Reinholz M. et al. (2012) Cathelicidin LL-37: An Antimicrobial Peptide with a Role in Inflammatory Skin Disease. Ann Dermatol 24, 2, 126- 136.
5) Huan Y. et al. (2020) Antimicrobial Peptides: Classification, Design, Application and Research Progress in Multiple Fields. Front. Microbiol. 11, 582779, 1-21.
Seznam doporučené literatury
1) Holaskova E. et al. (2015) Antimicrobial peptide production and plant-based expression systems for medical and agricultural biotechnology. Biotech Adv 33, 1005–1023.
2) Holaskova E. et al. (2018) Molecular Farming in Barley: Development of a Novel Production Platform to Produce Human Antimicrobial Peptide LL-37. Biotechnol J 13, 1700628 (1-10).
3) Mirzaee M. et al. (2021) Long-Lasting Stable Expression of Human LL-37 Antimicrobial Peptide in Transgenic Barley Plants. Antibiotics 10, 898.
4) Reinholz M. et al. (2012) Cathelicidin LL-37: An Antimicrobial Peptide with a Role in Inflammatory Skin Disease. Ann Dermatol 24, 2, 126- 136.
5) Huan Y. et al. (2020) Antimicrobial Peptides: Classification, Design, Application and Research Progress in Multiple Fields. Front. Microbiol. 11, 582779, 1-21.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu bakalářské práce studentky Alžbety Michalatové zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudků vedoucí práce RNDr. Lenky Dzurové, Ph.D. a oponenta doc. Ing. Tomáše Takáče, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
Cíle práce
Syntetické antimikrobiální látky, AMP, LL-37
Transgenní ječmen produkující rhLL-37
Design experimentální části – extrakce MBP_rhLL-37
Purifikace afinitní chromatografií, detekce fúzního proteinu, hodnocení efektivity metody
Precipitace proteinů síranem amonným
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
Absence porovnání použité metody s jinými
Formální chyby v použití referencích a odkazem na ně, absence odkazů na obrázky v textu
Způsoby zajištění použití stejného množství proteinů při purifikaci pomocí afinitní chromatografie
Nároky na čistotu AMP z rostlinného materiálu pro praktické použití pro farmaceutické a kosmetické účely
Metody použité na purifikaci AMP použité autory v literatuře
Výstupy z western-blotu, přítomnost i proteinů odlišné velikosti, možnosti průkazu přítomnosti dimeru-agregátu
Původ použité protilátky
Výtěžnost metody izolace proteinu, nejvhodnější podmínky izolace
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala pohotově, adekvátně se znalostí problematiky.