Jedním z nejčastěji studovaných mechanismů signalizace u rostlin je kaskáda mitogenem-aktivovaných protein kináz (MAPK), přenášející signály prostřednictvím fosforylace a defosforylace proteinů. MAPK aktivují a regulují velké množství rozličných jaderných, cytosolických či cytoskeletálních substrátů a jsou zapojeny do vývojových a obranných reakcí. Mezi nejvýznamnější MAPK u Medicago sativa se řadí SIMK neboli stresem indukovaná MAPK, k jejíž aktivaci dochází přenosem signálu z nadřazené SIMKK. Cílem této diplomové práce byla produkce transgenních rostlin M. sativa se sníženou expresí SIMKK (SIMKK-RNAi) v expresní linii GFP-FABD2 k vizualizaci aktinového cytoskeletu a v expresní linii tagRFP-TUA6 k vizualizaci mikrotubulového cytoskeletu. Transformace byla provedena prostřednictvím bakterií Agrobacterium tumefaciens a celý proces včetně následné regenerace stabilních dvojitých transgenních linií byl zdokumentován. U dvojitých transgenních linií SIMKK-RNAi tagRFP-TUA6 a SIMKK-RNAi GFP-FABD2 byla provedena imunoblotová analýza pro kvalitativní a semikvantitativní determinaci změn v úrovni produkce proteinu SIMK a mikroskopická analýza pro dokumentaci struktury, organizace a dynamiky mikrotubulového a aktinového cytoskeletu. Výsledky práce naznačují, že přítomnost SIMK a úroveň její exprese můžou mít regulační vliv na organizaci cytoskeletu v buňkách M. sativa.
Anotace v angličtině
One of the most studied signaling mechanisms in plants is the cascade of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), transmitting signals through protein phosphorylation and dephosphorylation. MAPKs activate and regulate many different nuclear, cytosolic, or cytoskeletal substrates and are involved in developmental and defense reactions. Among the most important MAPKs in Medicago sativa is SIMK or stress-induced MAPK, which is activated by signal transmission from the upstream SIMKK. The aim of this thesis was the production of transgenic M. sativa plants with reduced expression of SIMKK (SIMKK-RNAi) in the GFP-FABD2 expression line to visualize the actin cytoskeleton and in the tagRFP-TUA6 expression line to visualize the microtubules. Transformation was done through Agrobacterium tumefaciens and the whole process including the subsequent regeneration of stable double transgenic lines was documented. In the double transgenic lines SIMKK-RNAi tagRFP-TUA6 and SIMKK-RNAi GFP-FABD2, immunoblot analysis was performed for qualitative and semiquantitative determination of changes in the level of SIMK protein production, and microscopic analysis was performed for documentation of structure, organization and dynamics of the microtubule and actin cytoskeleton. The results indicate that the presence and expression level of SIMK may have an important regulatory impact to cytoskeleton organization in cells of M. sativa.
Jedním z nejčastěji studovaných mechanismů signalizace u rostlin je kaskáda mitogenem-aktivovaných protein kináz (MAPK), přenášející signály prostřednictvím fosforylace a defosforylace proteinů. MAPK aktivují a regulují velké množství rozličných jaderných, cytosolických či cytoskeletálních substrátů a jsou zapojeny do vývojových a obranných reakcí. Mezi nejvýznamnější MAPK u Medicago sativa se řadí SIMK neboli stresem indukovaná MAPK, k jejíž aktivaci dochází přenosem signálu z nadřazené SIMKK. Cílem této diplomové práce byla produkce transgenních rostlin M. sativa se sníženou expresí SIMKK (SIMKK-RNAi) v expresní linii GFP-FABD2 k vizualizaci aktinového cytoskeletu a v expresní linii tagRFP-TUA6 k vizualizaci mikrotubulového cytoskeletu. Transformace byla provedena prostřednictvím bakterií Agrobacterium tumefaciens a celý proces včetně následné regenerace stabilních dvojitých transgenních linií byl zdokumentován. U dvojitých transgenních linií SIMKK-RNAi tagRFP-TUA6 a SIMKK-RNAi GFP-FABD2 byla provedena imunoblotová analýza pro kvalitativní a semikvantitativní determinaci změn v úrovni produkce proteinu SIMK a mikroskopická analýza pro dokumentaci struktury, organizace a dynamiky mikrotubulového a aktinového cytoskeletu. Výsledky práce naznačují, že přítomnost SIMK a úroveň její exprese můžou mít regulační vliv na organizaci cytoskeletu v buňkách M. sativa.
Anotace v angličtině
One of the most studied signaling mechanisms in plants is the cascade of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), transmitting signals through protein phosphorylation and dephosphorylation. MAPKs activate and regulate many different nuclear, cytosolic, or cytoskeletal substrates and are involved in developmental and defense reactions. Among the most important MAPKs in Medicago sativa is SIMK or stress-induced MAPK, which is activated by signal transmission from the upstream SIMKK. The aim of this thesis was the production of transgenic M. sativa plants with reduced expression of SIMKK (SIMKK-RNAi) in the GFP-FABD2 expression line to visualize the actin cytoskeleton and in the tagRFP-TUA6 expression line to visualize the microtubules. Transformation was done through Agrobacterium tumefaciens and the whole process including the subsequent regeneration of stable double transgenic lines was documented. In the double transgenic lines SIMKK-RNAi tagRFP-TUA6 and SIMKK-RNAi GFP-FABD2, immunoblot analysis was performed for qualitative and semiquantitative determination of changes in the level of SIMK protein production, and microscopic analysis was performed for documentation of structure, organization and dynamics of the microtubule and actin cytoskeleton. The results indicate that the presence and expression level of SIMK may have an important regulatory impact to cytoskeleton organization in cells of M. sativa.
1) Vypracování literární rešerše na téma aktivace signálních drah ve vývojových procesech a při odpovědi na stresové faktory u rostlin, významu MAPK signálních modulů při kompartmentalizaci přenosu signálů v buňce, významu druhu Medicago sativa L., a dosud známých funkcí MAPK a MAPKK u vojtěšky. Dále na téma rostlinného cytoskeletu, transgenoze u rostlin se speciálním zaměřením na vojtěšku, metod vnášení nebo umlčování genů a selekce pozitivních transgenů pomocí genotypování transformovaných rostlin.
2) Zvládnutí regenerace a kultivace kontrolních a transgenních rostlin vojtěšky in vitro procesem somatické embryogeneze.
3) Praktická transformace listových segmentů vojtěšky s cílem indukce a regenerace stabilních transgenních linií se sníženou expresí vybraných mitogenem-aktivovaných protein kináz, a s expresí markerů aktinového cytoskeletu a mikrotubulů.
4) Molekulární, biochemická a strukturní charakterizace aktinového cytoskeletu a mikrotubulů ve stabilně transformovaných liniích vojtěšky se sníženou expresí vybraných mitogenem-aktivovaných protein kináz.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Zásady pro vypracování
1) Vypracování literární rešerše na téma aktivace signálních drah ve vývojových procesech a při odpovědi na stresové faktory u rostlin, významu MAPK signálních modulů při kompartmentalizaci přenosu signálů v buňce, významu druhu Medicago sativa L., a dosud známých funkcí MAPK a MAPKK u vojtěšky. Dále na téma rostlinného cytoskeletu, transgenoze u rostlin se speciálním zaměřením na vojtěšku, metod vnášení nebo umlčování genů a selekce pozitivních transgenů pomocí genotypování transformovaných rostlin.
2) Zvládnutí regenerace a kultivace kontrolních a transgenních rostlin vojtěšky in vitro procesem somatické embryogeneze.
3) Praktická transformace listových segmentů vojtěšky s cílem indukce a regenerace stabilních transgenních linií se sníženou expresí vybraných mitogenem-aktivovaných protein kináz, a s expresí markerů aktinového cytoskeletu a mikrotubulů.
4) Molekulární, biochemická a strukturní charakterizace aktinového cytoskeletu a mikrotubulů ve stabilně transformovaných liniích vojtěšky se sníženou expresí vybraných mitogenem-aktivovaných protein kináz.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Seznam doporučené literatury
1) Hrbáčková M, Luptovčiak I, Hlaváčková K, Dvořák P, Tichá M, Šamajová O, Novák D, Bednarz H, Niehaus K, Ovečka M, and Šamaj J (2021) Overexpression of alfalfa SIMK promotes root hair growth, nodule clustering and shoot biomass production. Plant Biotechnology Journal 19, 767-784.
2) Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annual Review of Plant Biology, published online February 2018, doi: 10.1146/annurev-arplant-042817-040314.
3) Hrbáčková M, Dvořák P, Takáč T, Tichá M, Luptovčiak I, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2020) Biotechnological perspectives of OMICs and genetic engineering methods in alfalfa. Frontiers in Plant Science 11:592.
4) Tichá M, Illésová P, Hrbáčková M, Basheer J, Novák D, Hlaváčková K, Šamajová O, Niehaus K, Ovečka M, Šamaj J(2020) Tissue culture, genetic transformation, interaction with beneficial microbes, and modern bio-imaging techniques in alfalfa research, Critical Reviews in Biotechnology 40, 1265-1280.
5) Ovečka M, Takáč T, Komis G, Vadovič P, Bekešová S, Doskočilová A, Smékalová V, Luptovčiak I, Šamajová O, Schweighofer A, Meskiene I, Jonak C, Křenek P, Lichtscheidl I, Skultety L, Hirt H, Šamaj J (2014) Salt-induced subcellular kinase relocation and seeding susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 65(9), 2335-2350.
6) Bekešová S, Komis G, Křenek P, Vyplelová P, Ovečka M, Luptovčiak I, Illés P, Kuchařová A, Šamaj J (2015) Monitoring protein phosphorylation by acrylamide pendant Phos-Tag™ in various plants. Frontiers in Plant Science 6:336
7) Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances 32(1), 2-11.
8) Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science 18(3), 140-148.
9) Šamajová O, Plíhal O, Al-Yousif M, Hirt H, Šamaj J (2013) Improvement of stress tolerance in plants by genetic manipulation of mitogen-activated protein kinases. Biotechnology Advances 31(1),118-128.
10) Liang P, Schmitz C, Lace B, Ditengou FA, Su C, Schulze E, Knerr J, Grosse R, Keller J, Libourel C, Delaux PM, Ott T (2021) Formin-mediated bridging of cell wall, plasma membrane, and cytoskeleton in symbiotic infections of Medicago truncatula. Current Biology 31: 2712-2719
11) Tsyganov VE, Kitaeva AB, Demchenko KN (2020) Comparative analysis of tubulin cytoskeleton rearrangements in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum. The Model Legume Medicago truncatula, First Edition. Edited by Frans J. de Bruijn. JohnWiley & Sons, Inc., 547-553
12) Kitaeva AB, Demchenko KN, Tikhonovich IA, Timmers ACJ, Tsyganov VE (2016) Comparative analysis of the tubulin cytoskeleton organization in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum: bacterial release and bacteroid positioning correlate with characteristic microtubule rearrangements. New Phytologist 210: 168–183
13) Fournier J, Timmers ACJ, Sieberer BJ, Jauneau A, Chabaud M, Barker DG (2008) Mechanism of infection thread elongation in root hairs of Medicago truncatula and dynamic interplay with associated Rhizobial colonization. Plant Physiology 148: 1985–1995.
Seznam doporučené literatury
1) Hrbáčková M, Luptovčiak I, Hlaváčková K, Dvořák P, Tichá M, Šamajová O, Novák D, Bednarz H, Niehaus K, Ovečka M, and Šamaj J (2021) Overexpression of alfalfa SIMK promotes root hair growth, nodule clustering and shoot biomass production. Plant Biotechnology Journal 19, 767-784.
2) Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annual Review of Plant Biology, published online February 2018, doi: 10.1146/annurev-arplant-042817-040314.
3) Hrbáčková M, Dvořák P, Takáč T, Tichá M, Luptovčiak I, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2020) Biotechnological perspectives of OMICs and genetic engineering methods in alfalfa. Frontiers in Plant Science 11:592.
4) Tichá M, Illésová P, Hrbáčková M, Basheer J, Novák D, Hlaváčková K, Šamajová O, Niehaus K, Ovečka M, Šamaj J(2020) Tissue culture, genetic transformation, interaction with beneficial microbes, and modern bio-imaging techniques in alfalfa research, Critical Reviews in Biotechnology 40, 1265-1280.
5) Ovečka M, Takáč T, Komis G, Vadovič P, Bekešová S, Doskočilová A, Smékalová V, Luptovčiak I, Šamajová O, Schweighofer A, Meskiene I, Jonak C, Křenek P, Lichtscheidl I, Skultety L, Hirt H, Šamaj J (2014) Salt-induced subcellular kinase relocation and seeding susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 65(9), 2335-2350.
6) Bekešová S, Komis G, Křenek P, Vyplelová P, Ovečka M, Luptovčiak I, Illés P, Kuchařová A, Šamaj J (2015) Monitoring protein phosphorylation by acrylamide pendant Phos-Tag™ in various plants. Frontiers in Plant Science 6:336
7) Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances 32(1), 2-11.
8) Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science 18(3), 140-148.
9) Šamajová O, Plíhal O, Al-Yousif M, Hirt H, Šamaj J (2013) Improvement of stress tolerance in plants by genetic manipulation of mitogen-activated protein kinases. Biotechnology Advances 31(1),118-128.
10) Liang P, Schmitz C, Lace B, Ditengou FA, Su C, Schulze E, Knerr J, Grosse R, Keller J, Libourel C, Delaux PM, Ott T (2021) Formin-mediated bridging of cell wall, plasma membrane, and cytoskeleton in symbiotic infections of Medicago truncatula. Current Biology 31: 2712-2719
11) Tsyganov VE, Kitaeva AB, Demchenko KN (2020) Comparative analysis of tubulin cytoskeleton rearrangements in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum. The Model Legume Medicago truncatula, First Edition. Edited by Frans J. de Bruijn. JohnWiley & Sons, Inc., 547-553
12) Kitaeva AB, Demchenko KN, Tikhonovich IA, Timmers ACJ, Tsyganov VE (2016) Comparative analysis of the tubulin cytoskeleton organization in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum: bacterial release and bacteroid positioning correlate with characteristic microtubule rearrangements. New Phytologist 210: 168–183
13) Fournier J, Timmers ACJ, Sieberer BJ, Jauneau A, Chabaud M, Barker DG (2008) Mechanism of infection thread elongation in root hairs of Medicago truncatula and dynamic interplay with associated Rhizobial colonization. Plant Physiology 148: 1985–1995.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc: Můžete vysvětlit variabilitu v abundanci aktinu mezi jednotlivými rostlinami?
doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.: Jak si vysvětlujete sníženou abundanci GFP-FABD2 u rostlin SIMKK RNAi linie?