Dědičné poruchy metabolismu sacharidů mohou být klinicky velmi rozmanité. Některé poruchy vyžadují okamžitou lékařskou pomoc, zatímco jiné mohou probíhat zcela asymptomaticky. Při rozvoji těchto poruch dochází k akumulaci charakteristických sacharidů a polyolů v tělních tekutinách. Současná analýza těchto látek je doménou tenkovrstevné chromatografie a GC-MS. Technika GC-MS se vyznačuje vysokou citlivostí a selektivitou, avšak její aplikace je časově náročná. S přihlédnutím na pacienty vyžadující urgentní péči se nabízí zjednodušit a zrychlit analýzu sacharidů a polyolů, a tím urychlit diagnostiku poruch metabolismu sacharidů.
V této diplomové práci byly zpracovány dosavadní poznatky týkající se poruch metabolismu sacharidů, které byly použity při vývoji nové LC MS/MS metody pro simultánní analýzu 28 sacharidů a polyolů v moči. Jedná se o diagnostickou platformu pro více než 20 dědičných metabolických poruch. Byla provedena částečná validace metody, která zahrnovala stanovení linearity, limitu detekce a kvantifikace. Nově vyvinutá metoda byla aplikována na vzorky pacientů s dědičnými metabolickými poruchami, jejichž diagnózy byly konfirmovány.
Anotace v angličtině
Inherited disorders of carbohydrate metabolism can be clinically very diverse. Some disorders require immediate medical attention, while others may be completely asymptomatic. Specific carbohydrates and polyols accumulate in body fluids during the development of these disorders. At the present time, the thin-layer chromatography and GC-MS are the most used methods for the analysis of these substances. Although the GC-MS is characterized by high sensitivity and selectivity, its implementation is time consuming. Taking the patients in need or urgent care into consideration, it is necessary to simplify and expedite its analysis, and thus improve the diagnosis of carbohydrate metabolism disorders.
In this diploma thesis, the previous findings related to inherited metabolic disorders affecting the metabolism of carbohydrates were processed. The obtained information were used in the process of developing a new LC-MS/MS method. This method can be used for the simultaneous analysis of 28 carbohydrates and polyols in urine and thus is effective in diagnosing more than 20 diseases. A partial validation of the method was performed, this validation included determination of linearity, limit of detection and quantification. This new method was applied to urine samples of patients with inherited metabolic disorders, whose diagnoses were confirmed.
inherited metabolic disorders, carbohydrate metabolism, diagnosis of diseases, liquid chromatography, mass spectrometry
Rozsah průvodní práce
84
Jazyk
CZ
Anotace
Dědičné poruchy metabolismu sacharidů mohou být klinicky velmi rozmanité. Některé poruchy vyžadují okamžitou lékařskou pomoc, zatímco jiné mohou probíhat zcela asymptomaticky. Při rozvoji těchto poruch dochází k akumulaci charakteristických sacharidů a polyolů v tělních tekutinách. Současná analýza těchto látek je doménou tenkovrstevné chromatografie a GC-MS. Technika GC-MS se vyznačuje vysokou citlivostí a selektivitou, avšak její aplikace je časově náročná. S přihlédnutím na pacienty vyžadující urgentní péči se nabízí zjednodušit a zrychlit analýzu sacharidů a polyolů, a tím urychlit diagnostiku poruch metabolismu sacharidů.
V této diplomové práci byly zpracovány dosavadní poznatky týkající se poruch metabolismu sacharidů, které byly použity při vývoji nové LC MS/MS metody pro simultánní analýzu 28 sacharidů a polyolů v moči. Jedná se o diagnostickou platformu pro více než 20 dědičných metabolických poruch. Byla provedena částečná validace metody, která zahrnovala stanovení linearity, limitu detekce a kvantifikace. Nově vyvinutá metoda byla aplikována na vzorky pacientů s dědičnými metabolickými poruchami, jejichž diagnózy byly konfirmovány.
Anotace v angličtině
Inherited disorders of carbohydrate metabolism can be clinically very diverse. Some disorders require immediate medical attention, while others may be completely asymptomatic. Specific carbohydrates and polyols accumulate in body fluids during the development of these disorders. At the present time, the thin-layer chromatography and GC-MS are the most used methods for the analysis of these substances. Although the GC-MS is characterized by high sensitivity and selectivity, its implementation is time consuming. Taking the patients in need or urgent care into consideration, it is necessary to simplify and expedite its analysis, and thus improve the diagnosis of carbohydrate metabolism disorders.
In this diploma thesis, the previous findings related to inherited metabolic disorders affecting the metabolism of carbohydrates were processed. The obtained information were used in the process of developing a new LC-MS/MS method. This method can be used for the simultaneous analysis of 28 carbohydrates and polyols in urine and thus is effective in diagnosing more than 20 diseases. A partial validation of the method was performed, this validation included determination of linearity, limit of detection and quantification. This new method was applied to urine samples of patients with inherited metabolic disorders, whose diagnoses were confirmed.
inherited metabolic disorders, carbohydrate metabolism, diagnosis of diseases, liquid chromatography, mass spectrometry
Zásady pro vypracování
Vypracování rešerše na téma: Diagnostika vybraných dědičných metabolických poruch a vývoj a validace LC-MS/MS metody.
Vývoj a validace LC-MS/MS metody pro diagnostiku vybraných dědičných metabolických poruch.
Vyhodnocení a interpretace výsledků validace LC-MS/MS metody.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Vypracování rešerše na téma: Diagnostika vybraných dědičných metabolických poruch a vývoj a validace LC-MS/MS metody.
Vývoj a validace LC-MS/MS metody pro diagnostiku vybraných dědičných metabolických poruch.
Vyhodnocení a interpretace výsledků validace LC-MS/MS metody.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
J. Fernandes et al. (2008) Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch: 4. vyd., Triton, Praha, ČR.
N. Blau et al., ed. (2014) Physician's guide to the diagnosis, treatment, and follow-up of inherited metabolic diseases, Springer, Heidelberg, DEU.
N. Blau., M. Duran and K. M. Gibson (2008) Laboratory guide to the methods in biochemical genetics, Springer, Berlin, DEU.
L. Nováková and M. Douša (2013) Moderní HPLC separace v teorii a praxi I., Praha, ČR.
Wamelink MM, Struys EA, Huck JH, Roos B, van der Knaap MS, Jakobs C, Verhoeven NM. Quantification of sugar phosphate intermediates of the pentose phosphate pathway by LC-MS/MS: application to two new inherited defects of metabolism. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005 Aug 25;823(1):18-25. doi: 10.1016/j.jchromb.2005.01.001. Epub 2005 Jan 23. PMID: 16055050.
Wamelink MM, Smith DE, Jakobs C, Verhoeven NM. Analysis of polyols in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a useful tool for recognition of inborn errors affecting polyol metabolism. J Inherit Metab Dis. 2005;28(6):951-63. doi: 10.1007/s10545-005-0233-4. PMID: 16435188.
Seznam doporučené literatury
J. Fernandes et al. (2008) Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch: 4. vyd., Triton, Praha, ČR.
N. Blau et al., ed. (2014) Physician's guide to the diagnosis, treatment, and follow-up of inherited metabolic diseases, Springer, Heidelberg, DEU.
N. Blau., M. Duran and K. M. Gibson (2008) Laboratory guide to the methods in biochemical genetics, Springer, Berlin, DEU.
L. Nováková and M. Douša (2013) Moderní HPLC separace v teorii a praxi I., Praha, ČR.
Wamelink MM, Struys EA, Huck JH, Roos B, van der Knaap MS, Jakobs C, Verhoeven NM. Quantification of sugar phosphate intermediates of the pentose phosphate pathway by LC-MS/MS: application to two new inherited defects of metabolism. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005 Aug 25;823(1):18-25. doi: 10.1016/j.jchromb.2005.01.001. Epub 2005 Jan 23. PMID: 16055050.
Wamelink MM, Smith DE, Jakobs C, Verhoeven NM. Analysis of polyols in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a useful tool for recognition of inborn errors affecting polyol metabolism. J Inherit Metab Dis. 2005;28(6):951-63. doi: 10.1007/s10545-005-0233-4. PMID: 16435188.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce LC-MS/MS analýza cukrů a polyolů v moči pro diagnostiku vybraných dědičných metabolických poruch studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Danihlík: Jak je stabilní posun retenčního času galaktitolu a galaktitolu značeného 13C6? Jak je galaktitol stabilní v moči?
prof. Petřivalský: Jak si vysvětlujete zvýšené hladiny manitolu u některých pacientů?
dr. Dostálková: Jaký je potřeba objem moči pro jednu analýzu?