Informace o kvalifikační práci Analýza organických kyselín v biologických vzorkách metódou LC-MS/MS pre diagnostiku a štúdium patobiochémie vybraných ochorení
Organické acidúrie tvoria početnú skupinu dedičných metabolických porúch (DMP), počas ktorých dochádza k akumulácii organických kyselín a ich konjugátov (hlavne acylkarnitíny a acylglycíny) v bunkách a telových tekutinách. Dôsledkom akumulácie týchto látok dochádza k narušeniu acidobázickej rovnováhy organizmu a ďalej k takým symptómom, ktoré môžu v najhoršom prípade skončiť smrťou pacienta. Rutinne sú organické acidúrie diagnostikované metódou plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou (GC MS), avšak táto metóda prináša určité nedostatky, preto je snaha o jej nahradenie.
V teoretickej časti bola spracovaná literárna rešerš - úvod do problematiky dedičných metabolických porúch a organických acidúrií aj s príkladmi, ako je leucinóza, izovalerová acidúria a deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselín so stredne dlhým reťazcom. Bola spracovaná aj rešerš zaoberajúca sa súčasnými možnosťami analýzy organických kyselín a teóriou metódy kvapalinovej chromatografie v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC MS/MS).
V praktickej časti bola LC-MS/MS validovaná pre 140 látok zo skupiny organických kyselín, acylkarnitínov a acylglycínov. Overované boli parametre ako je linearita, presnosť a správnosť, matricové efekty a carry-over. Následne bola metóda použitá na analýzu vzoriek pacientov a zdravých kontrol. Pre transformáciu nameraných dát bolo zavedené robustné škálované hodnoty a zmeny hladín biomarkerov oproti zdravej populácii. Analýzy vzoriek pacientov s organickými acidúriami boli vyhodnotené pomocou robustne škálovaných hodnôt a výsledky boli vyobrazené pomocou programov GraphPad Prism a Cytoscape.
Anotace v angličtině
Organic acidurias are group of inherited errors of metabolism (IMDs), when organic acids and their conjugates (mainly acylcarnitines and acylglycines) are accumulated in cells and body fluids. The accumulation of these metabolites causes acidosis and symptoms that may even end with the patient's death. Organic acidurias are diagnosed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), but this method has specific negatives, so efforts are being made to replace the method.
In the theoretical part, a literature review - an introduction to IMD and organic acidurias with examples such as maple syrup urine disease, isovaleric aciduria and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency - was elaborated There is also a review of present possibilities of organic acid analysis and the theory of liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
In experimental part the LC-MS/MS was validated for 140 metabolites (organic acids, acylglycines, acylcarnitines). Carry-over, matrix effects, linearity, accuracy and precision, were verified. Then the method was used for the analysis of the patient and healthy control samples. The robust scaled values and the changes of the biomarkers levels against healthy controls was established for the transformation of measured data. The analysis of the patient samples with organic acidurias were evaluated and the results were imaged in GraphPad Prism and Cytoscape softwares.
Inherited metabolic disorders, organic acidurias, liquid chromatography, mass spectrometry, validation
Rozsah průvodní práce
88
Jazyk
SK
Anotace
Organické acidúrie tvoria početnú skupinu dedičných metabolických porúch (DMP), počas ktorých dochádza k akumulácii organických kyselín a ich konjugátov (hlavne acylkarnitíny a acylglycíny) v bunkách a telových tekutinách. Dôsledkom akumulácie týchto látok dochádza k narušeniu acidobázickej rovnováhy organizmu a ďalej k takým symptómom, ktoré môžu v najhoršom prípade skončiť smrťou pacienta. Rutinne sú organické acidúrie diagnostikované metódou plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou (GC MS), avšak táto metóda prináša určité nedostatky, preto je snaha o jej nahradenie.
V teoretickej časti bola spracovaná literárna rešerš - úvod do problematiky dedičných metabolických porúch a organických acidúrií aj s príkladmi, ako je leucinóza, izovalerová acidúria a deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselín so stredne dlhým reťazcom. Bola spracovaná aj rešerš zaoberajúca sa súčasnými možnosťami analýzy organických kyselín a teóriou metódy kvapalinovej chromatografie v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC MS/MS).
V praktickej časti bola LC-MS/MS validovaná pre 140 látok zo skupiny organických kyselín, acylkarnitínov a acylglycínov. Overované boli parametre ako je linearita, presnosť a správnosť, matricové efekty a carry-over. Následne bola metóda použitá na analýzu vzoriek pacientov a zdravých kontrol. Pre transformáciu nameraných dát bolo zavedené robustné škálované hodnoty a zmeny hladín biomarkerov oproti zdravej populácii. Analýzy vzoriek pacientov s organickými acidúriami boli vyhodnotené pomocou robustne škálovaných hodnôt a výsledky boli vyobrazené pomocou programov GraphPad Prism a Cytoscape.
Anotace v angličtině
Organic acidurias are group of inherited errors of metabolism (IMDs), when organic acids and their conjugates (mainly acylcarnitines and acylglycines) are accumulated in cells and body fluids. The accumulation of these metabolites causes acidosis and symptoms that may even end with the patient's death. Organic acidurias are diagnosed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), but this method has specific negatives, so efforts are being made to replace the method.
In the theoretical part, a literature review - an introduction to IMD and organic acidurias with examples such as maple syrup urine disease, isovaleric aciduria and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency - was elaborated There is also a review of present possibilities of organic acid analysis and the theory of liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
In experimental part the LC-MS/MS was validated for 140 metabolites (organic acids, acylglycines, acylcarnitines). Carry-over, matrix effects, linearity, accuracy and precision, were verified. Then the method was used for the analysis of the patient and healthy control samples. The robust scaled values and the changes of the biomarkers levels against healthy controls was established for the transformation of measured data. The analysis of the patient samples with organic acidurias were evaluated and the results were imaged in GraphPad Prism and Cytoscape softwares.
Inherited metabolic disorders, organic acidurias, liquid chromatography, mass spectrometry, validation
Zásady pro vypracování
Vypracovanie literárnej rešerše o doterajších poznatkoch diagnostiky dedičných metabolických porúch so zameraním na organické acidúrie
Vypracovanie literárnej rešerše o aktuálnom stave analýzy organických kyselín a ich konjugátov v biologických vzorkách
Validácia metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou
Príprava biologických vzoriek a ich analýza metódy LC-MS/MS, vyhodnotenie a štatistické spracovanie výsledkov, interpretácia nameraných dát
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Vypracovanie literárnej rešerše o doterajších poznatkoch diagnostiky dedičných metabolických porúch so zameraním na organické acidúrie
Vypracovanie literárnej rešerše o aktuálnom stave analýzy organických kyselín a ich konjugátov v biologických vzorkách
Validácia metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou
Príprava biologických vzoriek a ich analýza metódy LC-MS/MS, vyhodnotenie a štatistické spracovanie výsledkov, interpretácia nameraných dát
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
Körver-Keularts, I., Wang, P., Waterval, H., Kluijtmans, L., Wevers, R. A., Langhans, C. D., Scott, C., Habets, D., & Bierau, J. (2018). Fast and accurate quantitative organic acid analysis with LC-QTOF/MS facilitates screening of patients for inborn errors of metabolism. Journal of inherited metabolic disease, 41(3), 415–424. https://doi.org/10.1007/s10545-017-0129-0
Steinbusch, L., Wang, P., Waterval, H., Stassen, F., Coene, K., Engelke, U., Habets, D., Bierau, J., & Körver-Keularts, I. (2021). Targeted urine metabolomics with a graphical reporting tool for rapid diagnosis of inborn errors of metabolism. Journal of inherited metabolic disease, 44(5), 1113–1123. https://doi.org/10.1002/jimd.12385
Ivanovová, Eliška, Barbora Piskláková, Dana Dobešová, Aleš Kvasnička, and David Friedecký. 2021. "Novel LC-MS Tools for Diagnosing Inborn Errors of Metabolism.” Microchemical Journal. https://doi.org/10.1016/j.microc.2021.106654
BLAU, N., Marinus DURAN a Kenneth Michael GIBSON, c2008. Laboratory guide to the methods in biochemical genetics. Berlin: Springer. ISBN 978-3-540-76697-1.
Garg, U. and Smith, L. D. (2017) Biomarkers in Inborn Errors of Metabolism: Clinical Aspects and Laboratory Determination. Elsevier.
Seznam doporučené literatury
Körver-Keularts, I., Wang, P., Waterval, H., Kluijtmans, L., Wevers, R. A., Langhans, C. D., Scott, C., Habets, D., & Bierau, J. (2018). Fast and accurate quantitative organic acid analysis with LC-QTOF/MS facilitates screening of patients for inborn errors of metabolism. Journal of inherited metabolic disease, 41(3), 415–424. https://doi.org/10.1007/s10545-017-0129-0
Steinbusch, L., Wang, P., Waterval, H., Stassen, F., Coene, K., Engelke, U., Habets, D., Bierau, J., & Körver-Keularts, I. (2021). Targeted urine metabolomics with a graphical reporting tool for rapid diagnosis of inborn errors of metabolism. Journal of inherited metabolic disease, 44(5), 1113–1123. https://doi.org/10.1002/jimd.12385
Ivanovová, Eliška, Barbora Piskláková, Dana Dobešová, Aleš Kvasnička, and David Friedecký. 2021. "Novel LC-MS Tools for Diagnosing Inborn Errors of Metabolism.” Microchemical Journal. https://doi.org/10.1016/j.microc.2021.106654
BLAU, N., Marinus DURAN a Kenneth Michael GIBSON, c2008. Laboratory guide to the methods in biochemical genetics. Berlin: Springer. ISBN 978-3-540-76697-1.
Garg, U. and Smith, L. D. (2017) Biomarkers in Inborn Errors of Metabolism: Clinical Aspects and Laboratory Determination. Elsevier.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Analýza organických kyselín v biologických vzorkách metódou LC-MS/MS pre diagnostiku a štúdium patobiochémie vybraných ochorení studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponentky. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Danihlík: Mohla byste vysvětlit parametr RS a jak se počítá? Kolik jste měla interních standardů a jak jste je vztahovali ke svým analytům?
prof. Šebela: Jakou kolonu byste navrhla pro analýzu hydroxykyselin?
prof. Petřivalský: Jaká je stabilita uvedených analytů v moči?