V mechu Physcomitrella patens (čepenka odstálá) byl doposud zjištěn výskyt 12 rodin aldehyddehydrogenas (ALDH), z nichž právě rodina ALDH5 je tvořena NAD+-dependentními sukcinát-semialdehyddehydrogenasami (SSADH) lokalizovanými v mitochondriích. SSADH hrají důležitou roli v katabolismu -aminomáselné kyseliny, neboť katalyzují přeměnu toxického sukcinát-semialdehydu (SSAL) na sukcinát.
Diplomová práce je zaměřena na charakterizaci přirozeně se vyskytujícího typu (WT) a mutantních forem (R189A, R307A, S470A) PpALDH5B, dále se zabývá studiem aktivního místa a genovou expresí vybraných PpALDH genů. U studovaných enzymů byly stanoveny kinetické parametry pro substrát SSAL i oktanal. Při měření se SSAL byla u PpALDH5B-WT pozorována inhibici nadbytkem substrátu, zatímco mutantní formy vykazovaly kinetiku Michaelise a Mentenové. Dále byla u PpALDH5B-R189A a PpALDH5B-R307A pozorována široká substrátová specificita k alifatickým aldehydům, z nichž nejlepším substrátem byl oktanal. To je způsobeno změnou residua Arg v aktivním místě enzymu, které je nezbytné pro katalýzu. Strukturně proteiny vytváří homotetramery s větším zastoupením helixů, na jejichž stabilitu má pozitivní vliv přídavek NaCl o koncentraci 1 mol.l-1 či vyšší pH.
U deficientních mutantních linií čepenky odstálé byla také studována genová exprese pomocí real-time PCR metody pro vybrané ALDH geny.
Anotace v angličtině
So far, 12 families of aldehyde dehydrogenase (ALDH) have been found in the moss Physcomitrella patens. The ALDH5 family consists of NAD+-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase (SSADH) localized in mitochondria. SSADHs play an important role in catabolism of -amino butyric acid. They catalyse the conversion of toxic succinate-semialdehyde (SSAL) to succinate.
The diploma thesis is focused on characterization of wild type (WT) and mutant forms (namely R189A, R307A, and S470A) of PpALDH5B, it also deals with the study of its active site and gene expression of selected PpALDH genes. Kinetic parameters of the studied enzymes were determined for the substrate SSAL and octaldehyde.
When measured with the SSAL, the inhibition by substrate was observed for PpALDH5B-WT while all the mutant forms exhibited classical Michaelis-Menten kinetics. Also a broad substrate specificity for aliphatic aldehydes was observed with PpALDH5B-R189A and PpALDH5B-R307A. Moreover, octaldehyde revealed as the best substrate. This effect is caused due to the change of Arg residue in the enzyme active site, which is necessary for catalysis. Structurally, the proteins form homotetramers with a greater abundance of helixes and the stability is positively influenced by addition of NaCl about a concentration of 1 mol.l-1 or higher pH.
The expression of selected ALDH genes were studied in deficient mutant lines of P. patens by real-time PCR method.
Klíčová slova
ALDH5, GABA, SSAL, SSADH, Physcomitrella patens
Klíčová slova v angličtině
ALDH5, GABA, SSAL, SSADH, Physcomitrella patens
Rozsah průvodní práce
64 s.
Jazyk
CZ
Anotace
V mechu Physcomitrella patens (čepenka odstálá) byl doposud zjištěn výskyt 12 rodin aldehyddehydrogenas (ALDH), z nichž právě rodina ALDH5 je tvořena NAD+-dependentními sukcinát-semialdehyddehydrogenasami (SSADH) lokalizovanými v mitochondriích. SSADH hrají důležitou roli v katabolismu -aminomáselné kyseliny, neboť katalyzují přeměnu toxického sukcinát-semialdehydu (SSAL) na sukcinát.
Diplomová práce je zaměřena na charakterizaci přirozeně se vyskytujícího typu (WT) a mutantních forem (R189A, R307A, S470A) PpALDH5B, dále se zabývá studiem aktivního místa a genovou expresí vybraných PpALDH genů. U studovaných enzymů byly stanoveny kinetické parametry pro substrát SSAL i oktanal. Při měření se SSAL byla u PpALDH5B-WT pozorována inhibici nadbytkem substrátu, zatímco mutantní formy vykazovaly kinetiku Michaelise a Mentenové. Dále byla u PpALDH5B-R189A a PpALDH5B-R307A pozorována široká substrátová specificita k alifatickým aldehydům, z nichž nejlepším substrátem byl oktanal. To je způsobeno změnou residua Arg v aktivním místě enzymu, které je nezbytné pro katalýzu. Strukturně proteiny vytváří homotetramery s větším zastoupením helixů, na jejichž stabilitu má pozitivní vliv přídavek NaCl o koncentraci 1 mol.l-1 či vyšší pH.
U deficientních mutantních linií čepenky odstálé byla také studována genová exprese pomocí real-time PCR metody pro vybrané ALDH geny.
Anotace v angličtině
So far, 12 families of aldehyde dehydrogenase (ALDH) have been found in the moss Physcomitrella patens. The ALDH5 family consists of NAD+-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase (SSADH) localized in mitochondria. SSADHs play an important role in catabolism of -amino butyric acid. They catalyse the conversion of toxic succinate-semialdehyde (SSAL) to succinate.
The diploma thesis is focused on characterization of wild type (WT) and mutant forms (namely R189A, R307A, and S470A) of PpALDH5B, it also deals with the study of its active site and gene expression of selected PpALDH genes. Kinetic parameters of the studied enzymes were determined for the substrate SSAL and octaldehyde.
When measured with the SSAL, the inhibition by substrate was observed for PpALDH5B-WT while all the mutant forms exhibited classical Michaelis-Menten kinetics. Also a broad substrate specificity for aliphatic aldehydes was observed with PpALDH5B-R189A and PpALDH5B-R307A. Moreover, octaldehyde revealed as the best substrate. This effect is caused due to the change of Arg residue in the enzyme active site, which is necessary for catalysis. Structurally, the proteins form homotetramers with a greater abundance of helixes and the stability is positively influenced by addition of NaCl about a concentration of 1 mol.l-1 or higher pH.
The expression of selected ALDH genes were studied in deficient mutant lines of P. patens by real-time PCR method.
Klíčová slova
ALDH5, GABA, SSAL, SSADH, Physcomitrella patens
Klíčová slova v angličtině
ALDH5, GABA, SSAL, SSADH, Physcomitrella patens
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Zpracování literární rešerše týkající se mechu Physcomitrella patens, metabolismu aldehydů v rostlinné říši a nadrodiny rostlinných aldehyddehydrogenas se zaměřením na rodinu aldehyddehydrogenas 5
Experimentální část:
Exprese a purifikace mutantních forem aldehyddehydrogenasy 5B z Physcomitrella patens pomocí afinitní a gelové chromatografie
Charakterizace kinetických a fyzikálně-chemických vlastností WT a mutantních forem PpALDH5B
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Zpracování literární rešerše týkající se mechu Physcomitrella patens, metabolismu aldehydů v rostlinné říši a nadrodiny rostlinných aldehyddehydrogenas se zaměřením na rodinu aldehyddehydrogenas 5
Experimentální část:
Exprese a purifikace mutantních forem aldehyddehydrogenasy 5B z Physcomitrella patens pomocí afinitní a gelové chromatografie
Charakterizace kinetických a fyzikálně-chemických vlastností WT a mutantních forem PpALDH5B
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
Brocker C., Vasiliou M., Carpenter S., Carpenter C., Zhang Y., Wang X., Kotchoni S. O., Wood A.J., Kirch H.H., Kopečný D., Nebert D.W., Vasiliou V. (2013): Aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily in plants: gene nomenclature and comparative genomics. Planta237, 189-210.
Končitíková R., Vigoroux A., Kopečná M., Andree T., Bartoš J., Šebela M., Solange M, Kopečný D. (2015): Role and structural characterization of plant aldehyde dehydrogenases from family 2 and family 7. Biochemical Journal468, 109-123.
Kopečná M., Vigouroux A., Vilím J., Končitíková R., Briozzo P., Hájková E., Jašková L., von Schwartzenberg K., Šebela M., Solange M, Kopečný D. (2017): The ALDH 21 gene found in lower plants and some vascular plants codes for a NADP+‐dependent succinic semialdehyde dehydrogenase. The Plant Journal92, 229-243.
Kopečný D., Končitíková R., Tylichová M., Vigouroux A., Moskalíková H., Soural M., Šebela M., Moréra S. (2013): Plant ALDH10 family identifying critical residues for substrate specificity and trapping a thiohemiacetal intermediate. Journal of Biological Chemistry288, 9491-9507.
Seznam doporučené literatury
Brocker C., Vasiliou M., Carpenter S., Carpenter C., Zhang Y., Wang X., Kotchoni S. O., Wood A.J., Kirch H.H., Kopečný D., Nebert D.W., Vasiliou V. (2013): Aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily in plants: gene nomenclature and comparative genomics. Planta237, 189-210.
Končitíková R., Vigoroux A., Kopečná M., Andree T., Bartoš J., Šebela M., Solange M, Kopečný D. (2015): Role and structural characterization of plant aldehyde dehydrogenases from family 2 and family 7. Biochemical Journal468, 109-123.
Kopečná M., Vigouroux A., Vilím J., Končitíková R., Briozzo P., Hájková E., Jašková L., von Schwartzenberg K., Šebela M., Solange M, Kopečný D. (2017): The ALDH 21 gene found in lower plants and some vascular plants codes for a NADP+‐dependent succinic semialdehyde dehydrogenase. The Plant Journal92, 229-243.
Kopečný D., Končitíková R., Tylichová M., Vigouroux A., Moskalíková H., Soural M., Šebela M., Moréra S. (2013): Plant ALDH10 family identifying critical residues for substrate specificity and trapping a thiohemiacetal intermediate. Journal of Biological Chemistry288, 9491-9507.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Charakterizace a studium aktivního místa mutantních forem aldehyddehydrogenasy 5B z mechu Physcomitrella patens studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
prof. Šebela: Jaký standard jste používala pro stanovení?
prof. Petřivalský: ROS jsou popsány pouze u lidské formy nebo i u rostlinné?