Informace o kvalifikační práci Analýza metabolitů a aktivit enzymů zapojených do metabolismu reaktivních forem kyslíku v semenech planých a kulturních genotypů hrachu
Reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou molekuly odvozené od kyslíku, přirozeně vznikající v rámci metabolismu. Jsou signálními molekulami, podílejí se na regulaci řady důležitých dějů, ale ve vyšších koncentracích působí toxicky. Aby byla zajištěna redoxní rovnováha a správná funkce biologických systémů v rostlinách, a tedy i semenech, musí být přítomny mechanismy, které se podílejí na regulaci koncentrace ROS. Tyto obranné mechanismy zahrnují antioxidanty, látky enzymové i neenzymové povahy.
Cílem diplomové práce byla analýza antioxidantů a antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS v průběhu vývoje semen kulturních (Cameor, JI92) a planých (JI64, JI1794) genotypů hrachu. Studovanými parametry byla celková antioxidační kapacita, koncentrace fenolů, flavonoidů, aktivita polyfenoloxidasy (PPO), peroxidasy (POX), askorbátperoxidasy (APX) a katalasy (CAT). Dále byla měřena exprese genu PPO a bylo provedeno histochemické stanovení aktivity PPO, POX a ROS v osemení studovaných genotypů.
V rámci experimentální části DP byly prokázány změny v obsahu antioxidantů a aktivit antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS, ke kterým dochází v průběhu vývoje semen planých a kulturních genotypů hrachu. Z výsledků provedených experimentů a porovnání jednotlivých parametrů mezi jednotlivými genotypy, vývojovými stádii a mezi osemením a embryem vyplývá výrazná odlišnost semen genotypu Cameor od semen ostatních genotypů (JI92, JI64, JI1794). V semenech genotypu Cameor byla výrazně nižší koncentrace neenzymových antioxidantů, velmi nízká aktivita PPO, ale naopak aktivity antioxidačních enzymů byly v porovnání s ostatními genotypy výrazně vyšší. Byl tak potvrzen předpoklad rozdílného zapojení studovaných parametrů ve vývoji osemení jednotlivých genotypů, které korelovalo s pigmentací osemení. Bylo potvrzeno, že v průběhu vývoje semen planých a kulturních genotypů hrachu dochází ke změnám v obsahu antioxidantů a aktivit antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS.
Anotace v angličtině
Reactive oxygen species (ROS) are molecules derived from oxygen, naturally occurring as part of metabolism. They are signal molecules, they participate in the regulation of a number of important events, but in higher concentrations they are toxic. In order to ensure redox balance and proper functioning of biological systems in plants, and thus also in seeds, mechanisms involved in the regulation of ROS concentration must be present. These defense mechanisms include antioxidants, substances of enzymatic and non-enzymatic nature.
The aim of the thesis was the analysis of antioxidants and antioxidant enzymes involved in ROS metabolism during seed development of cultivated (Cameor, JI92) and wild (JI64, JI1794) pea genotypes. The studied parameters were total antioxidant capacity, concentration of phenols, flavonoids, activity of polyphenoloxidase (PPO), peroxidase (POX), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT). Furthermore, the expression of the PPO gene was measured and histochemical determination of PPO, POX and ROS activity was performed in the seedcoat of the studied genotypes.
Within the experimental part of the thesis, changes in the content of antioxidants and the activities of antioxidant enzymes involved in ROS metabolism, which occur during the development of seeds of wild and cultured pea genotypes, were demonstrated. From the results of the experiments and the comparison of individual parameters between individual genotypes, developmental stages and between seedcoat and embryo, there is a significant difference between the seeds of the Cameor genotype and the seeds of the other genotypes (JI92, JI64, JI1794). In the seeds of the Cameor genotype, the concentration of non-enzymatic antioxidants was significantly lower, the activity of PPO was very low, but on the contrary, the activities of antioxidant enzymes were significantly higher compared to the other genotypes. Thus, the assumption of different involvement of the studied parameters in the development of the seedcoat of individual genotypes, which was correlated with the pigmentation of the seedcoat, was confirmed. It was confirmed that during the development of seeds of wild and cultured pea genotypes there are changes in the content of antioxidants and activities of antioxidant enzymes involved in ROS metabolism.
Klíčová slova
Reaktivní formy kyslíku, hrách, osemení, embryo, antioxidační kapacita, antioxidační enzymy, vývoj semene
Reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou molekuly odvozené od kyslíku, přirozeně vznikající v rámci metabolismu. Jsou signálními molekulami, podílejí se na regulaci řady důležitých dějů, ale ve vyšších koncentracích působí toxicky. Aby byla zajištěna redoxní rovnováha a správná funkce biologických systémů v rostlinách, a tedy i semenech, musí být přítomny mechanismy, které se podílejí na regulaci koncentrace ROS. Tyto obranné mechanismy zahrnují antioxidanty, látky enzymové i neenzymové povahy.
Cílem diplomové práce byla analýza antioxidantů a antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS v průběhu vývoje semen kulturních (Cameor, JI92) a planých (JI64, JI1794) genotypů hrachu. Studovanými parametry byla celková antioxidační kapacita, koncentrace fenolů, flavonoidů, aktivita polyfenoloxidasy (PPO), peroxidasy (POX), askorbátperoxidasy (APX) a katalasy (CAT). Dále byla měřena exprese genu PPO a bylo provedeno histochemické stanovení aktivity PPO, POX a ROS v osemení studovaných genotypů.
V rámci experimentální části DP byly prokázány změny v obsahu antioxidantů a aktivit antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS, ke kterým dochází v průběhu vývoje semen planých a kulturních genotypů hrachu. Z výsledků provedených experimentů a porovnání jednotlivých parametrů mezi jednotlivými genotypy, vývojovými stádii a mezi osemením a embryem vyplývá výrazná odlišnost semen genotypu Cameor od semen ostatních genotypů (JI92, JI64, JI1794). V semenech genotypu Cameor byla výrazně nižší koncentrace neenzymových antioxidantů, velmi nízká aktivita PPO, ale naopak aktivity antioxidačních enzymů byly v porovnání s ostatními genotypy výrazně vyšší. Byl tak potvrzen předpoklad rozdílného zapojení studovaných parametrů ve vývoji osemení jednotlivých genotypů, které korelovalo s pigmentací osemení. Bylo potvrzeno, že v průběhu vývoje semen planých a kulturních genotypů hrachu dochází ke změnám v obsahu antioxidantů a aktivit antioxidačních enzymů zapojených v metabolismu ROS.
Anotace v angličtině
Reactive oxygen species (ROS) are molecules derived from oxygen, naturally occurring as part of metabolism. They are signal molecules, they participate in the regulation of a number of important events, but in higher concentrations they are toxic. In order to ensure redox balance and proper functioning of biological systems in plants, and thus also in seeds, mechanisms involved in the regulation of ROS concentration must be present. These defense mechanisms include antioxidants, substances of enzymatic and non-enzymatic nature.
The aim of the thesis was the analysis of antioxidants and antioxidant enzymes involved in ROS metabolism during seed development of cultivated (Cameor, JI92) and wild (JI64, JI1794) pea genotypes. The studied parameters were total antioxidant capacity, concentration of phenols, flavonoids, activity of polyphenoloxidase (PPO), peroxidase (POX), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT). Furthermore, the expression of the PPO gene was measured and histochemical determination of PPO, POX and ROS activity was performed in the seedcoat of the studied genotypes.
Within the experimental part of the thesis, changes in the content of antioxidants and the activities of antioxidant enzymes involved in ROS metabolism, which occur during the development of seeds of wild and cultured pea genotypes, were demonstrated. From the results of the experiments and the comparison of individual parameters between individual genotypes, developmental stages and between seedcoat and embryo, there is a significant difference between the seeds of the Cameor genotype and the seeds of the other genotypes (JI92, JI64, JI1794). In the seeds of the Cameor genotype, the concentration of non-enzymatic antioxidants was significantly lower, the activity of PPO was very low, but on the contrary, the activities of antioxidant enzymes were significantly higher compared to the other genotypes. Thus, the assumption of different involvement of the studied parameters in the development of the seedcoat of individual genotypes, which was correlated with the pigmentation of the seedcoat, was confirmed. It was confirmed that during the development of seeds of wild and cultured pea genotypes there are changes in the content of antioxidants and activities of antioxidant enzymes involved in ROS metabolism.
Klíčová slova
Reaktivní formy kyslíku, hrách, osemení, embryo, antioxidační kapacita, antioxidační enzymy, vývoj semene
Vypracování literární rešerše na zadané téma s klíčovými slovy: reaktivní formy kyslíku, hrách, osemení, embryo, antioxidační kapacita, antioxidační enzymy, vývoj semene.
Experimentální část:
Sledované parametry stanovit v osemení i embryu semen kulturních a planých genotypů hrachu setého v různých vývojových stádiích.
Změřit antioxidační kapacitu a koncentraci flavonoidů a fenolických látek.
Histochemicky lokalizovat produkci reaktivních forem kyslíku, aktivitu polyfenoloxidasy a peroxidasy.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Vypracování literární rešerše na zadané téma s klíčovými slovy: reaktivní formy kyslíku, hrách, osemení, embryo, antioxidační kapacita, antioxidační enzymy, vývoj semene.
Experimentální část:
Sledované parametry stanovit v osemení i embryu semen kulturních a planých genotypů hrachu setého v různých vývojových stádiích.
Změřit antioxidační kapacitu a koncentraci flavonoidů a fenolických látek.
Histochemicky lokalizovat produkci reaktivních forem kyslíku, aktivitu polyfenoloxidasy a peroxidasy.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
Kumar et al., 2015: Seed birth to death: dual functions of reactive oxygen species in seed physiology. Ann Bot. 116(4): 663–668.
Ma et al., 2016: Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species Mediate Metabolic Changes in Barley Seed Embryo during Germination. Front. Plant Sci. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00138
Ishibashi et al., 2017: The Interrelationship between Abscisic Acid and Reactive Oxygen Species Plays a Key Role in Barley Seed Dormancy and Germination. Front. Plant Sci. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00275
Kurek et al., 2019: Reactive Oxygen Species as Potential Drivers of the Seed Aging Process. Plants 2019, 8(6), 174; https://doi.org/10.3390/plants8060174
Seznam doporučené literatury
Kumar et al., 2015: Seed birth to death: dual functions of reactive oxygen species in seed physiology. Ann Bot. 116(4): 663–668.
Ma et al., 2016: Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species Mediate Metabolic Changes in Barley Seed Embryo during Germination. Front. Plant Sci. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00138
Ishibashi et al., 2017: The Interrelationship between Abscisic Acid and Reactive Oxygen Species Plays a Key Role in Barley Seed Dormancy and Germination. Front. Plant Sci. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00275
Kurek et al., 2019: Reactive Oxygen Species as Potential Drivers of the Seed Aging Process. Plants 2019, 8(6), 174; https://doi.org/10.3390/plants8060174
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Analýza metabolitů a aktivit enzymů zapojených do metabolismu reaktivních forem kyslíku v semenech planých a kulturních genotypů hrachu studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponentky. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
prof. Šebela: Je rozdíl v dormantních a nedormantních genotypech hrachu v aktivitě SOD?
dr. Dostálková: Používáte nějaký marker pro určení stáří semene?
prof. Petřivalský: Jedná se o spektrofotometrického stanovení o oxidasovou nebo peroxidasovou aktivitu - jak tyto dva procesy ve stanovení odlišíte? A u histochemického stanovení?