Cytokinindehydrogenasa (CKX; EC 1.5.99.12) je flavoenzym, který obsahuje kovalentně navázaný kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD). Kofaktor FAD je navázán k histidinu, který je součástí konzervovaného vazebného motivu GHS, prostřednictvím vazby 8-N1-histidyl. Cílem experimentální části bakalářské práce byla cílená mutageneze ve vazebném motivu kofaktoru FAD u CKX z Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), pomocí PCR. ChtCKX obsahuje místo konzervovaného vazebného motivu GHS vazebný motiv AHS a zároveň neobsahuje kovalentně navázaný kofaktor FAD. Pro cílenou mutagenezi byl použit plasmid pTYB12::ChtCKX a primery s požadovanou mutací. Mutagenizovaný plasmid pTYB12::ChtCKX A104G byl vyizolován ze čtyř náhodně vybraných kolonií a následně sekvenován. Vytvoření požadované mutace a správnost nukleotidové sekvence ChtCKX A104G byly vyhodnoceny porovnáním s původní sekvencí genu ChtCKX. U dvou plasmidů došlo v genu ChtCKX k námi požadované mutaci a zároveň nedošlo k jiné nežádoucí mutaci.
Anotace v angličtině
Cytokinin dehydrogenase (CKX; EC 1.5.99.12) is a flavoenzyme that contains a covalently bound flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor. The FAD cofactor is bound via the 8-N1-histidyl bond to histidine, which is a part of the conserved GHS binding motif. The aim of the experimental part of the Bachelor thesis was site-directed mutagenesis in the binding motif of the FAD cofactor in CKX from Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), using PCR. ChtCKX contains an AHS binding motif instead of the conserved GHS binding motif and does not contain a covalently bound FAD cofactor. Plasmid pTYB12::ChtCKX and primers with the desired mutation were used for targeted mutagenesis. The mutagenized plasmid pTYB12::ChtCKX A104G was isolated from four randomly selected colonies and subsequently sequenced. The generation of the desired mutation and the correctness of the nucleotide sequence of ChtCKX A104G were evaluated by comparison with the original sequence of the ChtCKX gene. Two of the plasmids contained the desired mutation in the ChtCKX gene and at the same time did not contain other undesirable mutations.
Cytokinindehydrogenasa (CKX; EC 1.5.99.12) je flavoenzym, který obsahuje kovalentně navázaný kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD). Kofaktor FAD je navázán k histidinu, který je součástí konzervovaného vazebného motivu GHS, prostřednictvím vazby 8-N1-histidyl. Cílem experimentální části bakalářské práce byla cílená mutageneze ve vazebném motivu kofaktoru FAD u CKX z Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), pomocí PCR. ChtCKX obsahuje místo konzervovaného vazebného motivu GHS vazebný motiv AHS a zároveň neobsahuje kovalentně navázaný kofaktor FAD. Pro cílenou mutagenezi byl použit plasmid pTYB12::ChtCKX a primery s požadovanou mutací. Mutagenizovaný plasmid pTYB12::ChtCKX A104G byl vyizolován ze čtyř náhodně vybraných kolonií a následně sekvenován. Vytvoření požadované mutace a správnost nukleotidové sekvence ChtCKX A104G byly vyhodnoceny porovnáním s původní sekvencí genu ChtCKX. U dvou plasmidů došlo v genu ChtCKX k námi požadované mutaci a zároveň nedošlo k jiné nežádoucí mutaci.
Anotace v angličtině
Cytokinin dehydrogenase (CKX; EC 1.5.99.12) is a flavoenzyme that contains a covalently bound flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor. The FAD cofactor is bound via the 8-N1-histidyl bond to histidine, which is a part of the conserved GHS binding motif. The aim of the experimental part of the Bachelor thesis was site-directed mutagenesis in the binding motif of the FAD cofactor in CKX from Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), using PCR. ChtCKX contains an AHS binding motif instead of the conserved GHS binding motif and does not contain a covalently bound FAD cofactor. Plasmid pTYB12::ChtCKX and primers with the desired mutation were used for targeted mutagenesis. The mutagenized plasmid pTYB12::ChtCKX A104G was isolated from four randomly selected colonies and subsequently sequenced. The generation of the desired mutation and the correctness of the nucleotide sequence of ChtCKX A104G were evaluated by comparison with the original sequence of the ChtCKX gene. Two of the plasmids contained the desired mutation in the ChtCKX gene and at the same time did not contain other undesirable mutations.
1. Literární přehled známých poznatků o struktuře cytokinindehydrogenas a příbuzných flavoproteinů se zaměřením na vazbu flavinového kofaktoru
2. Místně-cílená mutageneze ve vazebném motivu flavinového kofaktoru
3. Vyhodnocení a diskuse výsledků
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Zásady pro vypracování
1. Literární přehled známých poznatků o struktuře cytokinindehydrogenas a příbuzných flavoproteinů se zaměřením na vazbu flavinového kofaktoru
2. Místně-cílená mutageneze ve vazebném motivu flavinového kofaktoru
3. Vyhodnocení a diskuse výsledků
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Seznam doporučené literatury
Původní časopisecká literatura související s tématem práce a podle doporučení vedoucí práce.
1. Malito E., Coda A., Bilyeu K. D., Fraaije M. W., Mattevi A. (2004) Structures of Michaelis and product complexes of plant cytokinin dehydrogenase: Implications for flavoenzym catalysis. J. Mol. Biol. 341, 1237-1249.
2. Heuts D. P. H. M., Scrutton N. S., McIntire W. S., Fraaije M. W. (2009) What?s in a covalent bond? On the role and formation of covalently bound flavin cofactors. FEBS J. 276, 3405-3427.
3. Frébort I., Kowalska M., Hluska T., Frébortová J., Galuzska P. (2011) Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation. J. Exp. Bot. 62, 2431-2452.
4. Frébortová J., Greplová M., Seidl M. F., Heyl A., Frébort I. (2015) Biochemical characterization of putative adenylate dimethylallyltransferase and cytokinin dehydrogenase from Nostoc sp. PCC 7120. Plos One 10. e0138468.
5. Kopečný D., Končitíková R., Popelka H., Briozzo P., Vigouroux A., Kopečná M., Zalabák D., Šebela M., Skopalová J., Frébort I., Moréra S. (2016) Kinetic and structural investigation of the cytokinin oxidase/dehydrogenase active site. FEBS J. 283, 361-377.
Seznam doporučené literatury
Původní časopisecká literatura související s tématem práce a podle doporučení vedoucí práce.
1. Malito E., Coda A., Bilyeu K. D., Fraaije M. W., Mattevi A. (2004) Structures of Michaelis and product complexes of plant cytokinin dehydrogenase: Implications for flavoenzym catalysis. J. Mol. Biol. 341, 1237-1249.
2. Heuts D. P. H. M., Scrutton N. S., McIntire W. S., Fraaije M. W. (2009) What?s in a covalent bond? On the role and formation of covalently bound flavin cofactors. FEBS J. 276, 3405-3427.
3. Frébort I., Kowalska M., Hluska T., Frébortová J., Galuzska P. (2011) Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation. J. Exp. Bot. 62, 2431-2452.
4. Frébortová J., Greplová M., Seidl M. F., Heyl A., Frébort I. (2015) Biochemical characterization of putative adenylate dimethylallyltransferase and cytokinin dehydrogenase from Nostoc sp. PCC 7120. Plos One 10. e0138468.
5. Kopečný D., Končitíková R., Popelka H., Briozzo P., Vigouroux A., Kopečná M., Zalabák D., Šebela M., Skopalová J., Frébort I., Moréra S. (2016) Kinetic and structural investigation of the cytokinin oxidase/dehydrogenase active site. FEBS J. 283, 361-377.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse studentka zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Ing. Pavel Křenek, Ph.D.: Jakou funkci má enzym DpnI v cílené mutagenezi sekvence DNA?