Cílem této práce je zkoumaní oxidačního stresu u tří lidských nádorových buněčných linií (U-937, THP-1, HL-60) pomocí různých technologií. U-937 je promonocytární buněčná linie lidské myeloidní leukemie, zatímco buněčná linie THP-1 je typ lidské monocytární leukemie, která byla získána z krve jedince s akutní monocytární leukemií. Buněčná linie HL-60, byla získána od pacienta s akutní myeloidní leukémií. Diferenciace buněk byla indukována pomocí phorbol 12-myristát-13-acetátu (PMA), což vedlo k tvorbě reaktivních forem kyslíku v buňkách. Tvorba těchto reaktivních forem kyslíku byla detekována pomocí zobrazovacího zařízení s nábojovou vazbou (CCD), fotonásobiče (PMT), Western blotu a spektroskopie elektronové paramagnetické rezonance (EPR). Pomocí CCD kamery a PMT bylo v různých stavech detekováno spontánní zobrazování ultra slabých fotonů. Zatímco tvorba radikálu s centrovaným uhlíkem byla měřena v EPR spektroskopii. Kromě toho bylo studováno potenciální využití přírodních sloučenin pro jejich antioxidační účinky v různých buněčných liniích pomocí Western blottingu.
Anotace v angličtině
The objectives include the investigation of oxidative stress in three human cancer cell lines (U-937, THP-1, HL-60) using different technologies. U-937 is a pro-monocytic human myeloid leukaemia cell line, while the THP-1 cell line is a type of human monocytic leukaemia that was obtained from the blood of an individual with acute monocytic leukaemia. The HL-60 cell line was obtained from a patient with acute myeloid leukaemia. Differentiation of the cells was induced by phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), which led to the formation of reactive oxygen species in the cells. The formation of this reactive oxygen species was detected using charge-coupled device (CCD imaging), Photomultiplier tube (PMT), Western blotting, and electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR). Spontaneous ultra-weak photon emission imaging was detected by CCD camera and PMT in different states. The formation of carbon-centred radicals was measured by EPR spin-trapping spectroscopy. Furthermore, the potential usage of natural compounds for their antioxidant effects in different cell lines was studied using Western blotting.
Klíčová slova
U-937, THP-1, HL-60 buněčné linie, Reaktivní formy kyslíku, volné radikály, zařízení s nábojovou vazbou (CCD), fotonásobič (PMT), Western blot, spektroskopie elektronové paramagnetické rezonance (EPR), bioaktivní sloučeniny.
Cílem této práce je zkoumaní oxidačního stresu u tří lidských nádorových buněčných linií (U-937, THP-1, HL-60) pomocí různých technologií. U-937 je promonocytární buněčná linie lidské myeloidní leukemie, zatímco buněčná linie THP-1 je typ lidské monocytární leukemie, která byla získána z krve jedince s akutní monocytární leukemií. Buněčná linie HL-60, byla získána od pacienta s akutní myeloidní leukémií. Diferenciace buněk byla indukována pomocí phorbol 12-myristát-13-acetátu (PMA), což vedlo k tvorbě reaktivních forem kyslíku v buňkách. Tvorba těchto reaktivních forem kyslíku byla detekována pomocí zobrazovacího zařízení s nábojovou vazbou (CCD), fotonásobiče (PMT), Western blotu a spektroskopie elektronové paramagnetické rezonance (EPR). Pomocí CCD kamery a PMT bylo v různých stavech detekováno spontánní zobrazování ultra slabých fotonů. Zatímco tvorba radikálu s centrovaným uhlíkem byla měřena v EPR spektroskopii. Kromě toho bylo studováno potenciální využití přírodních sloučenin pro jejich antioxidační účinky v různých buněčných liniích pomocí Western blottingu.
Anotace v angličtině
The objectives include the investigation of oxidative stress in three human cancer cell lines (U-937, THP-1, HL-60) using different technologies. U-937 is a pro-monocytic human myeloid leukaemia cell line, while the THP-1 cell line is a type of human monocytic leukaemia that was obtained from the blood of an individual with acute monocytic leukaemia. The HL-60 cell line was obtained from a patient with acute myeloid leukaemia. Differentiation of the cells was induced by phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), which led to the formation of reactive oxygen species in the cells. The formation of this reactive oxygen species was detected using charge-coupled device (CCD imaging), Photomultiplier tube (PMT), Western blotting, and electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR). Spontaneous ultra-weak photon emission imaging was detected by CCD camera and PMT in different states. The formation of carbon-centred radicals was measured by EPR spin-trapping spectroscopy. Furthermore, the potential usage of natural compounds for their antioxidant effects in different cell lines was studied using Western blotting.
Klíčová slova
U-937, THP-1, HL-60 buněčné linie, Reaktivní formy kyslíku, volné radikály, zařízení s nábojovou vazbou (CCD), fotonásobič (PMT), Western blot, spektroskopie elektronové paramagnetické rezonance (EPR), bioaktivní sloučeniny.
1.Vypracovat stručný přehled tvorby různých reaktivních druhů kyslíku v lidských buňkách (buňky U937
2.Naučit se postupy kultivace lidské buněčné linie a porozumět vzorci růstu, životaschopnosti a úmrtnosti.
3.Seznámit se s počítadly buněk, konfokální laserovou skenovací mikroskopií a elektronovou
paramagnetickou rezonanční spektroskopií, jejím ovládáním a detekční metodou ROS. Podrobně
popsat v protokolu.
4.Změřit tvorbu ROS generovaného v lidské buněčné linii a provádět zobrazování in vivo;
zúčastněné ve všech souvisejících měřeních.
5.Vyhodnotit naměřené výsledky a prodiskutovat je ve vztahu k literatuře.
6.Připravit bakalářskou práci.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Zásady pro vypracování
1.Vypracovat stručný přehled tvorby různých reaktivních druhů kyslíku v lidských buňkách (buňky U937
2.Naučit se postupy kultivace lidské buněčné linie a porozumět vzorci růstu, životaschopnosti a úmrtnosti.
3.Seznámit se s počítadly buněk, konfokální laserovou skenovací mikroskopií a elektronovou
paramagnetickou rezonanční spektroskopií, jejím ovládáním a detekční metodou ROS. Podrobně
popsat v protokolu.
4.Změřit tvorbu ROS generovaného v lidské buněčné linii a provádět zobrazování in vivo;
zúčastněné ve všech souvisejících měřeních.
5.Vyhodnotit naměřené výsledky a prodiskutovat je ve vztahu k literatuře.
6.Připravit bakalářskou práci.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Seznam doporučené literatury
1.C. Sundstrom and K. Nilsson: Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (u-937). International Journal of Cancer, 17(5), 565-577 (1976) doi:10.1002/ijc.2910170504
2.W. Chanput, J. J. Mes and H. J. Wichers: THP-1 cell line: An in vitro cell model for immune modulation approach. International Immunopharmacology, 23(1), 37-45 (2014) doi:10.1016/j.intimp.2014.08.002
3.M. Rác, M. Křupka, S. Binder, M. Sedlářová, Z. Matuskova, M. Raska and P. Pospíšil: Oxidative damage of U937 human leukemic cells caused by hydroxyl radical results in singlet oxygen formation. PLoS One, 10(3), e0116958 (2015) doi:10.1371/journal.pone.0116958
4.Pospíšil P, Prasad A, Rác M, Mechanism of the Formation of Electronically Excited Species by Oxidative Metabolic Processes: Role of Reactive Oxygen Species. Biomolecules 2019 (9) 258. doi.org/10.3390/biom9070258
5.Halliwell, B. & Gutteridge, J. Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 4. (Oxford University Press, 2007).
6.Prasad A, Sedlářová M, Pospíšil P. (2018) Singlet oxygen imaging using fluorescent probe Singlet Oxygen Sensor Green in photosynthetic organisms. Scientific Reports 8, 13685 https://doi.org/10.1038/s41598-018-31638-5.
7.Gopalakrishnan B, Nash KM, Velayutham M, Villamena FA (2012) Detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps. J Vis. Exp.18: e2810. doi: 10.3791/2810.
Seznam doporučené literatury
1.C. Sundstrom and K. Nilsson: Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (u-937). International Journal of Cancer, 17(5), 565-577 (1976) doi:10.1002/ijc.2910170504
2.W. Chanput, J. J. Mes and H. J. Wichers: THP-1 cell line: An in vitro cell model for immune modulation approach. International Immunopharmacology, 23(1), 37-45 (2014) doi:10.1016/j.intimp.2014.08.002
3.M. Rác, M. Křupka, S. Binder, M. Sedlářová, Z. Matuskova, M. Raska and P. Pospíšil: Oxidative damage of U937 human leukemic cells caused by hydroxyl radical results in singlet oxygen formation. PLoS One, 10(3), e0116958 (2015) doi:10.1371/journal.pone.0116958
4.Pospíšil P, Prasad A, Rác M, Mechanism of the Formation of Electronically Excited Species by Oxidative Metabolic Processes: Role of Reactive Oxygen Species. Biomolecules 2019 (9) 258. doi.org/10.3390/biom9070258
5.Halliwell, B. & Gutteridge, J. Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 4. (Oxford University Press, 2007).
6.Prasad A, Sedlářová M, Pospíšil P. (2018) Singlet oxygen imaging using fluorescent probe Singlet Oxygen Sensor Green in photosynthetic organisms. Scientific Reports 8, 13685 https://doi.org/10.1038/s41598-018-31638-5.
7.Gopalakrishnan B, Nash KM, Velayutham M, Villamena FA (2012) Detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps. J Vis. Exp.18: e2810. doi: 10.3791/2810.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Ing. Pavel Křenek, Ph.D.: Jaká byla koncentrace použitých sloučenin?
Mgr. Olga Šamajová, Dr.: Je možné využít konfokální mikroskopii k detekci superoxidového radikálu?
prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D.: Je možné tuto metodu použít i na individuální buňky? Jsou použité sloučeniny komerčně dostupné a jaká je jejich čistota?