Cílem této práce bylo vytvoření a optimalizace protokolu pro pre-purifikaci sideroforů na základě jejich afinity k proteinu Tear lipocalin, pro který jsou siderofory přirozeným ligandem. V rámci této práce byl vyprodukován rekombinantní Tear lipocalin, který byl následně izolován a charakterizován pomocí řady metod. Dále byl optimalizován protokol pro navázání Tear lipocalinu na kolonu s Ni-NTA agarosou, pro potřeby purifikace sideroforů.
Anotace v angličtině
The aim of this work was to create and optimize a protocol for the pre-purification of siderophores based on their affinity to the Tear lipocalin protein, for which siderophores are a natural ligand. As part of this work, recombinant Tear lipocalin was produced, isolated and characterized using a number of methods. Furthermore, the protocol for binding Tear lipocalin to a column with Ni-NTA agarose was optimized for siderophore purification.
Klíčová slova
siderofory, infekce, Tear lipocalin
Klíčová slova v angličtině
siderophores, infection, Tear lipocalin
Rozsah průvodní práce
61 s. (218 360 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Cílem této práce bylo vytvoření a optimalizace protokolu pro pre-purifikaci sideroforů na základě jejich afinity k proteinu Tear lipocalin, pro který jsou siderofory přirozeným ligandem. V rámci této práce byl vyprodukován rekombinantní Tear lipocalin, který byl následně izolován a charakterizován pomocí řady metod. Dále byl optimalizován protokol pro navázání Tear lipocalinu na kolonu s Ni-NTA agarosou, pro potřeby purifikace sideroforů.
Anotace v angličtině
The aim of this work was to create and optimize a protocol for the pre-purification of siderophores based on their affinity to the Tear lipocalin protein, for which siderophores are a natural ligand. As part of this work, recombinant Tear lipocalin was produced, isolated and characterized using a number of methods. Furthermore, the protocol for binding Tear lipocalin to a column with Ni-NTA agarose was optimized for siderophore purification.
Klíčová slova
siderofory, infekce, Tear lipocalin
Klíčová slova v angličtině
siderophores, infection, Tear lipocalin
Zásady pro vypracování
Teoretická část: Základní charakteristiky sideroforů a jejich zapojení do rozvoje infekce a obrany proti ní, možnosti laboratorního průkazu mikrobiální kolonizace a invaze u mykotických infekcí, využití průkazu mikrobiálních sideroforů v diagnostice infekčních chorob, MS technitky průkazu sideroforů, využití interakce sideroforových scavengerů k purifikaci sideroforů a možnosti rutinního laboratorního využití.
Praktická část: Vytvoření afinitní purifikační kolony pro izolaci sideroforů ze vzorku krve a ověření průkazu sideroforů pomocí MALDI TOF MS.
Zásady pro vypracování
Teoretická část: Základní charakteristiky sideroforů a jejich zapojení do rozvoje infekce a obrany proti ní, možnosti laboratorního průkazu mikrobiální kolonizace a invaze u mykotických infekcí, využití průkazu mikrobiálních sideroforů v diagnostice infekčních chorob, MS technitky průkazu sideroforů, využití interakce sideroforových scavengerů k purifikaci sideroforů a možnosti rutinního laboratorního využití.
Praktická část: Vytvoření afinitní purifikační kolony pro izolaci sideroforů ze vzorku krve a ověření průkazu sideroforů pomocí MALDI TOF MS.
Seznam doporučené literatury
Ali, S.S., Vidhale, N.N. (2016): Bacterial siderophore and their spplication : A review. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 2: 303-312.
Crosa, J.H., Walsh, C.T. (2002): Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 66: 223–249.
Ochsner, U.A., Vasil, A.I., Vasil, M.L. (1995): Role of the ferric uptake regulator of Pseudomonas aeruginosa in the regulation of siderophores and exotoxin A expression: Purification and activity on iron-regulated promoters. Journal of Bacteriology 177: 7194–7201.
Patel, A.K., Deshattiwar, M.K., Chaudhari, B.L., Chincholkar, S.B. (2009): Production, purification and chemical characterization of the catecholate siderophore from potent probiotic strains of Bacillus spp. Bioresource Technology 100: 368–373.
Pluhacek T., Lemr K., Ghosh D., Milde D., Novak J., Havlicek V. (2016): Characterization of microbial siderophores by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 35: 35-47
Sah, S., Singh, R. (2015): Siderophore: Structural and functional characterisation - A comprehensive review. Agriculture 61: 97–114.
Sayyed, R.Z., Chincholkar, S.B. (2006): Purification of siderophores of Alcaligenes faecalis on Amberlite XAD. Bioresource Technology 97: 1026–1029.
Schmiedel Y., Zimmerli S. (2016): Common invasive fungal diseases: an overview of invasive candidiasis, aspergillosis, cryptococcosis, and Pneumocystis pneumonia. Swiss medical weekly 146: w14281.
Skriba A., Pluhacek T., Palyzova A. (2018): Early and non-invasive diagnosis of Aspergillosis revealed by infection kinetics monitored in a rat model. Front. Microbiol. 9: 2356.
Winkelmann, G. (2002): Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society Transactions 30: 691–696.
Seznam doporučené literatury
Ali, S.S., Vidhale, N.N. (2016): Bacterial siderophore and their spplication : A review. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 2: 303-312.
Crosa, J.H., Walsh, C.T. (2002): Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 66: 223–249.
Ochsner, U.A., Vasil, A.I., Vasil, M.L. (1995): Role of the ferric uptake regulator of Pseudomonas aeruginosa in the regulation of siderophores and exotoxin A expression: Purification and activity on iron-regulated promoters. Journal of Bacteriology 177: 7194–7201.
Patel, A.K., Deshattiwar, M.K., Chaudhari, B.L., Chincholkar, S.B. (2009): Production, purification and chemical characterization of the catecholate siderophore from potent probiotic strains of Bacillus spp. Bioresource Technology 100: 368–373.
Pluhacek T., Lemr K., Ghosh D., Milde D., Novak J., Havlicek V. (2016): Characterization of microbial siderophores by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev 35: 35-47
Sah, S., Singh, R. (2015): Siderophore: Structural and functional characterisation - A comprehensive review. Agriculture 61: 97–114.
Sayyed, R.Z., Chincholkar, S.B. (2006): Purification of siderophores of Alcaligenes faecalis on Amberlite XAD. Bioresource Technology 97: 1026–1029.
Schmiedel Y., Zimmerli S. (2016): Common invasive fungal diseases: an overview of invasive candidiasis, aspergillosis, cryptococcosis, and Pneumocystis pneumonia. Swiss medical weekly 146: w14281.
Skriba A., Pluhacek T., Palyzova A. (2018): Early and non-invasive diagnosis of Aspergillosis revealed by infection kinetics monitored in a rat model. Front. Microbiol. 9: 2356.
Winkelmann, G. (2002): Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society Transactions 30: 691–696.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Veroniky Batkové zahájil prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce prof. Mgr. MUDr. Milana Rašky, Ph.D.
a oponentky Mgr. Milady Horynové Stuchlové, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
Diagnostika mikrobiálních infekcí – kultivace, problémy zpoždění diagnostiky
Současné diagnostické metody – přehled, využití, klady a zápory
Diagnostika pomocí hmotnostní spektrometrie – princip, komplikace, omezení
Siderofory – charakteristika, klasifikace, význam
Protein tear lipocalin – antimikrobiální aktivita a afinita k sideroforům
Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
Koncentrace zásobních roztoků IPTG a kanamycinu
Nutnost pre-purifikace sideroforů a další postup identifikace specifických markerů mikrobiální infekce
Vysvětlení CAS assay a vysvětlení pojmu „falešně negativní“ výsledek pro Fe-siderofor
Reálný případ existence sideroforu navázaného s antibiotikem pro léčbu infekce
Interakce tear lipocalinu a sideroforu a odraz jejich interakce na fyziologické úrovni
Studentka na dotazy položené oponentkou práce a členy komise reagovala věcně, pohotově a přiměřeně.