Auxin je rostlinný hormon, který ovlivňuje vývoj rostliny v mnoha aspektech. Rozhodující je především optimální koncentrace auxinu v daném pletivu. Auxinová homeostáza je udržována několika různými mechanismy, mezi něž se řadí také ukládání auxinu ve formě konjugátů. Auxinové amidohydrolasy jsou poté enzymy, které katalyzují hydrolýzu auxinových konjugátů za uvolnění volné formy auxinu, která je biologicky aktivní. Takto uvolněný auxin by mohl mít vliv na zakládání nodálních kořenů u ječmene (Hordeum vulgare L). V současné době byly auxinové amidohydrolasy identifikovány již u několika rostlinných druhů, jedná se například o huseníček rolní (Arabidopsis thaliana), rýži (Oryza sativa) nebo pšenici setou (Triticum aestivum). V oblasti auxinových amidohydrolas vyskytujících se v ječmeni je výzkum teprve v počátcích. V rámci bakalářské práce byla studována auxinová amidohydrolasa kódovaná genem HvILL2. Sekvence genu byla zaklonována do expresního vektoru pGEX-5x-1 a výsledný konstrukt byl sekvenován. Dále byl v rámci bakalářské práce navržen postup pro následnou transformaci plazmidů do expresních buněk E. coli BL21 Star (DE3), purifikaci rekombinantních proteinů a měření enzymové aktivity enzymu HvILL2 se substráty v podobě vybraných auxinových konjugátů.
Anotace v angličtině
Auxin is a plant hormone that affects development of the plant in many aspects. The optimal concentration of auxin in a given tissue is crucial. Auxin homeostasis is maintained by several different mechanisms, including the storage of auxin in the form of conjugates. Auxin amidohydrolases are enzymes that catalyse the hydrolysis of auxin conjugates to release a free form of auxin, which is biologically active. The released auxin could have an effect on the establishment of nodal roots in barley (Hordeum vulgare L). Currently, auxin amidohydrolases have been identified in several plant species, such as thale cress (Arabidopsis thaliana), rice (Oryza sativa) or wheat (Triticum aestivum). In the field of auxin amidohydrolases found in barley, research is only in its early stages. As part of the bachelor's thesis, an auxin amidohydrolas coded with the HvILL2 gene was studied. The gene sequence was cloned into the pGEX-5x-1 expression vector and the resulting construct was sequenced. In addition, the bachelor's thesis proposed a procedure for the subsequent transformation of plasmids into E. coli BL21 Star (DE3) expression cells, purification of recombinant proteins and measurement of enzyme activity of HvILL2 with substrates in the form of selected auxin conjugates.
Auxin je rostlinný hormon, který ovlivňuje vývoj rostliny v mnoha aspektech. Rozhodující je především optimální koncentrace auxinu v daném pletivu. Auxinová homeostáza je udržována několika různými mechanismy, mezi něž se řadí také ukládání auxinu ve formě konjugátů. Auxinové amidohydrolasy jsou poté enzymy, které katalyzují hydrolýzu auxinových konjugátů za uvolnění volné formy auxinu, která je biologicky aktivní. Takto uvolněný auxin by mohl mít vliv na zakládání nodálních kořenů u ječmene (Hordeum vulgare L). V současné době byly auxinové amidohydrolasy identifikovány již u několika rostlinných druhů, jedná se například o huseníček rolní (Arabidopsis thaliana), rýži (Oryza sativa) nebo pšenici setou (Triticum aestivum). V oblasti auxinových amidohydrolas vyskytujících se v ječmeni je výzkum teprve v počátcích. V rámci bakalářské práce byla studována auxinová amidohydrolasa kódovaná genem HvILL2. Sekvence genu byla zaklonována do expresního vektoru pGEX-5x-1 a výsledný konstrukt byl sekvenován. Dále byl v rámci bakalářské práce navržen postup pro následnou transformaci plazmidů do expresních buněk E. coli BL21 Star (DE3), purifikaci rekombinantních proteinů a měření enzymové aktivity enzymu HvILL2 se substráty v podobě vybraných auxinových konjugátů.
Anotace v angličtině
Auxin is a plant hormone that affects development of the plant in many aspects. The optimal concentration of auxin in a given tissue is crucial. Auxin homeostasis is maintained by several different mechanisms, including the storage of auxin in the form of conjugates. Auxin amidohydrolases are enzymes that catalyse the hydrolysis of auxin conjugates to release a free form of auxin, which is biologically active. The released auxin could have an effect on the establishment of nodal roots in barley (Hordeum vulgare L). Currently, auxin amidohydrolases have been identified in several plant species, such as thale cress (Arabidopsis thaliana), rice (Oryza sativa) or wheat (Triticum aestivum). In the field of auxin amidohydrolases found in barley, research is only in its early stages. As part of the bachelor's thesis, an auxin amidohydrolas coded with the HvILL2 gene was studied. The gene sequence was cloned into the pGEX-5x-1 expression vector and the resulting construct was sequenced. In addition, the bachelor's thesis proposed a procedure for the subsequent transformation of plasmids into E. coli BL21 Star (DE3) expression cells, purification of recombinant proteins and measurement of enzyme activity of HvILL2 with substrates in the form of selected auxin conjugates.
1) Vypracování literární rešerše zaměřené na vývoj nodálních kořenů ječmene, roli rostlinného hormonu auxinu v tomto procesu a dále charakterizaci auxinových amidohydrolas.
2) Příprava konstruktů pro produkci domnělých auxinových amidohydrolas z ječmene v bakteriálním expresním systému.
3) Produkce vybraných isoforem domnělých auxinových amidohydrolas v Escherichia coli.
4) Stanovení enzymové aktivity domnělých auxinových amidohydrolas.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Zásady pro vypracování
1) Vypracování literární rešerše zaměřené na vývoj nodálních kořenů ječmene, roli rostlinného hormonu auxinu v tomto procesu a dále charakterizaci auxinových amidohydrolas.
2) Příprava konstruktů pro produkci domnělých auxinových amidohydrolas z ječmene v bakteriálním expresním systému.
3) Produkce vybraných isoforem domnělých auxinových amidohydrolas v Escherichia coli.
4) Stanovení enzymové aktivity domnělých auxinových amidohydrolas.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Seznam doporučené literatury
1) Bartel, B., & Fink, G. (1995). ILR1, an amidohydrolase that releases active indole-3-acetic acid from conjugates. Science, 268(5218), 1745–1748. https://doi.org/10.1126/science.7792599
2) Bellini, C., Pacurar, D. I., & Perrone, I. (2014). Adventitious Roots and Lateral Roots: Similarities and Differences. Annual Review of Plant Biology, 65(1), 639–666. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-035645
3) Campanella, J. J., Olajide, A. F., Magnus, V., & Ludwig-Müller, J. (2004). A novel auxin conjugate hydrolase from wheat with substrate specificity for longer side-chain auxin amide conjugates. Plant Physiology, 135(4), 2230–2240. https://doi.org/10.1104/pp.104.043398
4) Davies, R. T., Goetz, D. H., Lasswell, J., Anderson, M. N., & Bartel, B. (1999). IAR3 encodes an auxin conjugate hydrolase from Arabidopsis. Plant Cell, 11(3), 365–376. https://doi.org/10.1105/tpc.11.3.365
5) Gonin, M., Bergougnoux, V., Nguyen, T. D., Gantet, P., & Champion, A. (2019). What makes adventitious roots? Plants, 8(7), 1–24. https://doi.org/10.3390/plants8070240
6) LeClere, S., Tellez, R., Rampey, R. A., Matsuda, S. P. T., & Bartel, B. (2002). Characterization of a family of IAA-amino acid conjugate hydrolases from Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 277(23), 20446–20452. https://doi.org/10.1074/jbc.M111955200
7) Ludwig-Müller, J. (2011). Auxin conjugates: Their role for plant development and in the evolution of land plants. Journal of Experimental Botany, 62(6), 1757–1773. https://doi.org/10.1093/jxb/erq412
8) Savić, B., Tomić, S., Magnus, V., Gruden, K., Barle, K., Grenković, R., Ludwig-Müller, J., & Salopek-Sondi, B. (2009). Auxin amidohydrolases from Brassica rapa cleave the alanine conjugate of indolepropionic acid as a preferable substrate: a biochemical and modeling approach. Plant & Cell Physiology, 50(9), 1587–1599. https://doi.org/10.1093/pcp/pcp101
9) Taylor-Teeples, M., Lanctot, A., & Nemhauser, J. L. (2016). As above, so below: Auxin’s role in lateral organ development. Developmental Biology, 419(1), 156–164. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.03.020
Seznam doporučené literatury
1) Bartel, B., & Fink, G. (1995). ILR1, an amidohydrolase that releases active indole-3-acetic acid from conjugates. Science, 268(5218), 1745–1748. https://doi.org/10.1126/science.7792599
2) Bellini, C., Pacurar, D. I., & Perrone, I. (2014). Adventitious Roots and Lateral Roots: Similarities and Differences. Annual Review of Plant Biology, 65(1), 639–666. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-035645
3) Campanella, J. J., Olajide, A. F., Magnus, V., & Ludwig-Müller, J. (2004). A novel auxin conjugate hydrolase from wheat with substrate specificity for longer side-chain auxin amide conjugates. Plant Physiology, 135(4), 2230–2240. https://doi.org/10.1104/pp.104.043398
4) Davies, R. T., Goetz, D. H., Lasswell, J., Anderson, M. N., & Bartel, B. (1999). IAR3 encodes an auxin conjugate hydrolase from Arabidopsis. Plant Cell, 11(3), 365–376. https://doi.org/10.1105/tpc.11.3.365
5) Gonin, M., Bergougnoux, V., Nguyen, T. D., Gantet, P., & Champion, A. (2019). What makes adventitious roots? Plants, 8(7), 1–24. https://doi.org/10.3390/plants8070240
6) LeClere, S., Tellez, R., Rampey, R. A., Matsuda, S. P. T., & Bartel, B. (2002). Characterization of a family of IAA-amino acid conjugate hydrolases from Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 277(23), 20446–20452. https://doi.org/10.1074/jbc.M111955200
7) Ludwig-Müller, J. (2011). Auxin conjugates: Their role for plant development and in the evolution of land plants. Journal of Experimental Botany, 62(6), 1757–1773. https://doi.org/10.1093/jxb/erq412
8) Savić, B., Tomić, S., Magnus, V., Gruden, K., Barle, K., Grenković, R., Ludwig-Müller, J., & Salopek-Sondi, B. (2009). Auxin amidohydrolases from Brassica rapa cleave the alanine conjugate of indolepropionic acid as a preferable substrate: a biochemical and modeling approach. Plant & Cell Physiology, 50(9), 1587–1599. https://doi.org/10.1093/pcp/pcp101
9) Taylor-Teeples, M., Lanctot, A., & Nemhauser, J. L. (2016). As above, so below: Auxin’s role in lateral organ development. Developmental Biology, 419(1), 156–164. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.03.020
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Role auxinových amidohydrolas při zakládání nodálních kořenů ječmene (Hordeum vulgare L.)
studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla na dotazy členů zkušební komise:
doc. Luhová: RNAsa degraduje buněčnou stěnu?
prof. Šebela: Existují nějaké alrenativní substráty?
dr. Škrabišová: Jak dopadla sekvenace těch dvou klonů? Navrhuji příště přidat k PCR kontroly - prázdný vektor, reakci bez templátu