Antimikrobiální peptidy jsou velice významnou složkou ochrany vyskytující se napříč všemi organismy. Velice důležitou roli přestavují v humorální imunitě živočichů. Tato diplomová práce je zaměřena především na hmyzí antimikrobiální peptidy. Je popsána obecná struktura antimikrobiálních peptidů, mechanismus jejich vzniku a účinku a případné rozdělení. Rovněž jsou popsány antimikrobiální peptidy, které se vyskytují u včely medonosné, jelikož jejich detekcí se zabývá následná experimentální část. V této části byly antimikrobiální peptidy obsažené ve včelí hemolymfě nejprve separovány pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu s následným Western blotem. Separované peptidy byly identifikovány metodou nLC-MALDI-TOF v příslušných oblastech molekulové hmotnosti získaných na základě imunochemické detekce. Identifikovány byly peptidy defensin-1 a hymenoptaecin. Abaecin nebylo možno tímto způsobem prokázat. Tímto tak byla ověřena specifita primárních protilátek cílených na dané peptidy, jichž bylo následně použito pro optimalizaci detekce peptidů ELISA metodou. Optimalizace ELISA metody pro vhodné stanovení daných antimikrobiálních peptidů probíhala v několika krocích, kdy bylo optimalizováno vhodné ředění jednotlivých protilátek specifických pro každý peptid a také sekundární protilátky, stejné pro všechny peptidy. Dále byly optimalizovány vhodné podmínky pro správný průběh imobilizace antigenu na povrch jamek a rovněž byl zkoumán vliv stáří roztoku pro přípravu chromogenního substrátu na výslednou absorbanci. Optimalizovaný postup metody byl vyzkoušen jak na vzorcích včelí hemolymfy, tak i na vzorcích proteinových extraktů z rozlišných částí včelího těla. ELISA metoda byla vyhodnocena jako další vhodná technika pro detekci a kvantifikaci antimikrobiálních peptidů.
Annotation in English
Antimicrobial peptides are a very significant component of immune protection occurring across all organisms. They play a very important role in the humoral immunity of animals. This diploma thesis is focused mainly on insect antimicrobial peptides. It describes the general structure of antimicrobial peptides, the mechanism of their formation, their effect, and possible division. Antimicrobial peptides that occur in honey bees are also described, as their detection is addressed in the following experimental section. In this section, the antimicrobial peptides contained in bee hemolymph were first separated by polyacrylamide gel electrophoresis, followed by Western blot. The separated peptides were identified by nLC-MALDI-TOF in the appropriate molecular weight regions obtained by immunochemical detection. The peptides defensin-1 and hymenoptaecin were identified. Abaecin could not be detected by this protocol. Thus, the specificity of the primary antibodies targeted to the given peptides was verified, it was subsequently used to optimize the detection of peptides by ELISA. The optimization of the ELISA method for the appropriate determination of the given antimicrobial peptides took place in several steps, when the appropriate dilutions of individual antibodies specific for each peptide as well as secondary antibodies, were tested and evaluated. Furthermore, suitable conditions for the antigen immobilization on the surface of the wells were optimized and the effect of the age of the solution for the preparation of the chromogenic substrate on the resulting absorbance was investigated. The optimized procedure of the method was tested both on samples of bee hemolymph and on samples of protein extracts from different parts of the bee body. The ELISA method was evaluated as another suitable technique for the detection and quantification of antimicrobial peptides.
Keywords
Antimikrobiální peptidy, abaecin, defensin, hymenoptaecin, ELISA, Western blot, včela medonosná
Keywords in English
Antimicrobial peptides, abaecin, defensin, hymenoptaecin, ELISA, Western blot, honeybee
Length of the covering note
75
Language
CZ
Annotation
Antimikrobiální peptidy jsou velice významnou složkou ochrany vyskytující se napříč všemi organismy. Velice důležitou roli přestavují v humorální imunitě živočichů. Tato diplomová práce je zaměřena především na hmyzí antimikrobiální peptidy. Je popsána obecná struktura antimikrobiálních peptidů, mechanismus jejich vzniku a účinku a případné rozdělení. Rovněž jsou popsány antimikrobiální peptidy, které se vyskytují u včely medonosné, jelikož jejich detekcí se zabývá následná experimentální část. V této části byly antimikrobiální peptidy obsažené ve včelí hemolymfě nejprve separovány pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu s následným Western blotem. Separované peptidy byly identifikovány metodou nLC-MALDI-TOF v příslušných oblastech molekulové hmotnosti získaných na základě imunochemické detekce. Identifikovány byly peptidy defensin-1 a hymenoptaecin. Abaecin nebylo možno tímto způsobem prokázat. Tímto tak byla ověřena specifita primárních protilátek cílených na dané peptidy, jichž bylo následně použito pro optimalizaci detekce peptidů ELISA metodou. Optimalizace ELISA metody pro vhodné stanovení daných antimikrobiálních peptidů probíhala v několika krocích, kdy bylo optimalizováno vhodné ředění jednotlivých protilátek specifických pro každý peptid a také sekundární protilátky, stejné pro všechny peptidy. Dále byly optimalizovány vhodné podmínky pro správný průběh imobilizace antigenu na povrch jamek a rovněž byl zkoumán vliv stáří roztoku pro přípravu chromogenního substrátu na výslednou absorbanci. Optimalizovaný postup metody byl vyzkoušen jak na vzorcích včelí hemolymfy, tak i na vzorcích proteinových extraktů z rozlišných částí včelího těla. ELISA metoda byla vyhodnocena jako další vhodná technika pro detekci a kvantifikaci antimikrobiálních peptidů.
Annotation in English
Antimicrobial peptides are a very significant component of immune protection occurring across all organisms. They play a very important role in the humoral immunity of animals. This diploma thesis is focused mainly on insect antimicrobial peptides. It describes the general structure of antimicrobial peptides, the mechanism of their formation, their effect, and possible division. Antimicrobial peptides that occur in honey bees are also described, as their detection is addressed in the following experimental section. In this section, the antimicrobial peptides contained in bee hemolymph were first separated by polyacrylamide gel electrophoresis, followed by Western blot. The separated peptides were identified by nLC-MALDI-TOF in the appropriate molecular weight regions obtained by immunochemical detection. The peptides defensin-1 and hymenoptaecin were identified. Abaecin could not be detected by this protocol. Thus, the specificity of the primary antibodies targeted to the given peptides was verified, it was subsequently used to optimize the detection of peptides by ELISA. The optimization of the ELISA method for the appropriate determination of the given antimicrobial peptides took place in several steps, when the appropriate dilutions of individual antibodies specific for each peptide as well as secondary antibodies, were tested and evaluated. Furthermore, suitable conditions for the antigen immobilization on the surface of the wells were optimized and the effect of the age of the solution for the preparation of the chromogenic substrate on the resulting absorbance was investigated. The optimized procedure of the method was tested both on samples of bee hemolymph and on samples of protein extracts from different parts of the bee body. The ELISA method was evaluated as another suitable technique for the detection and quantification of antimicrobial peptides.
Keywords
Antimikrobiální peptidy, abaecin, defensin, hymenoptaecin, ELISA, Western blot, včela medonosná
Keywords in English
Antimicrobial peptides, abaecin, defensin, hymenoptaecin, ELISA, Western blot, honeybee
Research Plan
Zpracování literární rešerše o významu antimikrobiálních peptidů (AmP) pro imunitní systém.
Zpracování literární rešerše o produkci AmP v jednotlivých orgánech hmyzu a jejich výskytu v hemocytech a hemolymfě, dále pak se zaměřením na včely, čmeláky a další sociální hmyz.
Rešerše metodických postupů imunochemických metod využívaných pro detekci a kvantifikaci biologicky aktivních peptidů (ELISA, Western blot, imunohistochemie) \textendash zpracování vzorků, provedení metod, příprava protilátek či Fv fragmentů.
Vypracování rešerše o ELISA metodě \textendash problematika přípravy protilátek, specifita protilátek, vyhodnocení výsledků, výběr sekundárních protilátek a detekce.
Optimalizace zpracování vzorků včel pro imunochemickou detekci AmP.
Optimalizace ELISA metody pro detekci a kvantifikaci včelích AmP \textendash hymenoptaecinu, defensinu1 a abaecinu s využitím standardů a reálných vzorků včel.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Research Plan
Zpracování literární rešerše o významu antimikrobiálních peptidů (AmP) pro imunitní systém.
Zpracování literární rešerše o produkci AmP v jednotlivých orgánech hmyzu a jejich výskytu v hemocytech a hemolymfě, dále pak se zaměřením na včely, čmeláky a další sociální hmyz.
Rešerše metodických postupů imunochemických metod využívaných pro detekci a kvantifikaci biologicky aktivních peptidů (ELISA, Western blot, imunohistochemie) \textendash zpracování vzorků, provedení metod, příprava protilátek či Fv fragmentů.
Vypracování rešerše o ELISA metodě \textendash problematika přípravy protilátek, specifita protilátek, vyhodnocení výsledků, výběr sekundárních protilátek a detekce.
Optimalizace zpracování vzorků včel pro imunochemickou detekci AmP.
Optimalizace ELISA metody pro detekci a kvantifikaci včelích AmP \textendash hymenoptaecinu, defensinu1 a abaecinu s využitím standardů a reálných vzorků včel.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Recommended resources
Danihlík, J., Aronstein, K. and Petřivalský, M. (2016). Antimicrobial peptides: a key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research54, 123-136.
Danihlik, J., Sebela, M., Petrivalsky, M. and Lenobel, R. (2014). A sensitive quantification of the peptide apidaecin 1 isoforms in single bee tissues using a weak cation exchange pre-separation and nanocapillary liquid chromatography coupled with mass spectrometry. J Chromatogr A1374, 134-144.
Bilikova, K. and Simuth, J. (2010). New Criterion for Evaluation of Honey: Quantification of Royal Jelly Protein Apalbumin 1 in Honey by ELISA. Journal of Agricultural and Food Chemistry58, 8776-8781.
Poláchová, V., Pastucha, M., Mikušová, Z., Mickert, M. J., Hlaváček, A., Gorris, H. H., Skládal, P. and Farka, Z. (2019). Click-conjugated photon-upconversion nanoparticles in an immunoassay for honeybee pathogen Melissococcus plutonius. Nanoscale11, 8343-8351.
Yamaguchi, K., He, S., Li, Z., Murata, K., Hitomi, N., Mozumi, M., Ariga, R. and Enomoto, T. (2013). Quantification of major royal jelly protein 1 in fresh royal jelly by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry77, 1310-1312.
Recommended resources
Danihlík, J., Aronstein, K. and Petřivalský, M. (2016). Antimicrobial peptides: a key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research54, 123-136.
Danihlik, J., Sebela, M., Petrivalsky, M. and Lenobel, R. (2014). A sensitive quantification of the peptide apidaecin 1 isoforms in single bee tissues using a weak cation exchange pre-separation and nanocapillary liquid chromatography coupled with mass spectrometry. J Chromatogr A1374, 134-144.
Bilikova, K. and Simuth, J. (2010). New Criterion for Evaluation of Honey: Quantification of Royal Jelly Protein Apalbumin 1 in Honey by ELISA. Journal of Agricultural and Food Chemistry58, 8776-8781.
Poláchová, V., Pastucha, M., Mikušová, Z., Mickert, M. J., Hlaváček, A., Gorris, H. H., Skládal, P. and Farka, Z. (2019). Click-conjugated photon-upconversion nanoparticles in an immunoassay for honeybee pathogen Melissococcus plutonius. Nanoscale11, 8343-8351.
Yamaguchi, K., He, S., Li, Z., Murata, K., Hitomi, N., Mozumi, M., Ariga, R. and Enomoto, T. (2013). Quantification of major royal jelly protein 1 in fresh royal jelly by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry77, 1310-1312.
Enclosed appendices
-
Appendices bound in thesis
illustrations, graphs, schemes
Taken from the library
Yes
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Imunochemická detekce a kvantifikace antimikrobiálních peptidů studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
doc. Luhová: Z jakých gelů byly použity vzorky pro MALDI-TOF?
dr. Jorda: V čem jste barvily gely po elektroforéze? Jaké je zastoupení dalších peptidů v oblasti zájmu? Jak se provádí odběr hemolymfy včel?
dr. Škrabišová: Co obsahuje “blank”?
dr. Sekaninová: Jaký je význam antimikrobiálních peptidů ve včelím jedu?