Diplomová práce se zaměřuje na problematiku detekce bodové mutace T315I v kinasové doméně fúzního genu BCR-ABL1 pomocí digitální PCR (dPCR) u pacientů s chronickou myeloidní leukémií (CML). CML se řadí do skupiny myeloproliferativních neoplázií s incidencí 1-2 případy na 100 000 obyvatel ročně. K léčbě jsou využívány inhibitory tyrosinkinas. U některých pacientů dochází k vývoji rezistence na léčbu. Jedním z důvodů je přítomnost mutací v kinasové doméně fúzního genu. Standardní metodou pro detekci mutací je Sangerovo sekvenování, které však není dostatečně senzitivní. Tento problém překonává dPCR, která je založena na rozdělení reakce do tisíců malých kompartmentů, v nichž probíhá PCR reakce samostatně. V rámci experimentální části byla optimalizována metoda dPCR pro detekci mutace T315I a následně vyšetřeno 28 vzorků ze souboru 14 pacientů. Bodová mutace T315I byla prokázána u 10/14 pacientů. Pomocí dPCR je možné detekovat přítomnost mutované alely v zastoupení až 0,01 %. Technologie dPCR má vyšší citlivost detekce než Sangerovo sekvenování.
Anotace v angličtině
This diploma thesis focuses on the detection of the T315I point mutation in the kinase domain of the BCR-ABL1 fusion gene by digital PCR (dPCR) in patients with chronic myeloid leukemia (CML). CML belongs to the group of myeloproliferative neoplasms with an incidence of 1-2 cases per 100,000 population per year. Tyrosine kinase inhibitors are used for treatment. Some patients develop resistance to treatment. One of the reasons is the presence of mutations in the kinase domain of the fusion gene. The standard method for detecting mutations is Sanger sequencing, which is not sensitive enough. This problem is overcome by dPCR, which is based on the division of the reaction into several thousand small compartments, in which the PCR reaction takes place separately. In the experimental part, the dPCR method was optimized for the detection of the T315I mutation and subsequently 28 samples from a group of 14 patients were examined. The T315I point mutation was detected in 10/14 patients. Using dPCR, it is possible to detect the presence of a mutated allele in a proportion of up to 0.01 %. dPCR technology has a higher detection sensitivity than Sanger sequencing.
Chronic myeloid leukemia, digital PCR, tyrosine kinase inhibitors, imatinib, resistance
Rozsah průvodní práce
62 s. (115182 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Diplomová práce se zaměřuje na problematiku detekce bodové mutace T315I v kinasové doméně fúzního genu BCR-ABL1 pomocí digitální PCR (dPCR) u pacientů s chronickou myeloidní leukémií (CML). CML se řadí do skupiny myeloproliferativních neoplázií s incidencí 1-2 případy na 100 000 obyvatel ročně. K léčbě jsou využívány inhibitory tyrosinkinas. U některých pacientů dochází k vývoji rezistence na léčbu. Jedním z důvodů je přítomnost mutací v kinasové doméně fúzního genu. Standardní metodou pro detekci mutací je Sangerovo sekvenování, které však není dostatečně senzitivní. Tento problém překonává dPCR, která je založena na rozdělení reakce do tisíců malých kompartmentů, v nichž probíhá PCR reakce samostatně. V rámci experimentální části byla optimalizována metoda dPCR pro detekci mutace T315I a následně vyšetřeno 28 vzorků ze souboru 14 pacientů. Bodová mutace T315I byla prokázána u 10/14 pacientů. Pomocí dPCR je možné detekovat přítomnost mutované alely v zastoupení až 0,01 %. Technologie dPCR má vyšší citlivost detekce než Sangerovo sekvenování.
Anotace v angličtině
This diploma thesis focuses on the detection of the T315I point mutation in the kinase domain of the BCR-ABL1 fusion gene by digital PCR (dPCR) in patients with chronic myeloid leukemia (CML). CML belongs to the group of myeloproliferative neoplasms with an incidence of 1-2 cases per 100,000 population per year. Tyrosine kinase inhibitors are used for treatment. Some patients develop resistance to treatment. One of the reasons is the presence of mutations in the kinase domain of the fusion gene. The standard method for detecting mutations is Sanger sequencing, which is not sensitive enough. This problem is overcome by dPCR, which is based on the division of the reaction into several thousand small compartments, in which the PCR reaction takes place separately. In the experimental part, the dPCR method was optimized for the detection of the T315I mutation and subsequently 28 samples from a group of 14 patients were examined. The T315I point mutation was detected in 10/14 patients. Using dPCR, it is possible to detect the presence of a mutated allele in a proportion of up to 0.01 %. dPCR technology has a higher detection sensitivity than Sanger sequencing.
Chronic myeloid leukemia, digital PCR, tyrosine kinase inhibitors, imatinib, resistance
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je určení mutací pomocí metody Digitální PCR u vybrané skupiny hematologických pacientů.
Stručný přehled literárních údajů zaměřených na problematiku stanovení mutací pomocí technologie Digitální PCR.
Experimentální část: výsledky vlastních analýz provedených metodou Digitální PCR.
Vyhodnocení zjištěných mutací u vybrané skupiny hematologických pacientů a určení jejich významu v diagnostice hematologických chorob.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je určení mutací pomocí metody Digitální PCR u vybrané skupiny hematologických pacientů.
Stručný přehled literárních údajů zaměřených na problematiku stanovení mutací pomocí technologie Digitální PCR.
Experimentální část: výsledky vlastních analýz provedených metodou Digitální PCR.
Vyhodnocení zjištěných mutací u vybrané skupiny hematologických pacientů a určení jejich významu v diagnostice hematologických chorob.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Seznam doporučené literatury
Drandi D., Genuardi E., Dogliotti I., Ferrante M., Jiménez C., Guerrini F., Schirico M. L., Mantoan B., Muccio V., Lia G., Zaccaria G. M., Omede P., Passera R., Orsucci L., Benevolo G., Cavallo F., Galimberti S., Sanz R. G., Boccadoro M., Ladetto M., Ferrero S. (2018): Highly sensitive MYD88L265P mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica103, 1029 \textendash 1037.
Cilloni D., Petiti J., Rosso V., Andreani G., Dragani M., Fava C., Saglio G. (2019): Digital PCR in Myeloid Malignancies: Ready to Replace Quantitative PCR? International Journal of Molecular Sciences 20(9): 2249 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6540058/.
Coccaro N., Tota G., Anelli L., Zagaria A., Specchia G., Albano F. (2020): Digital PCR: A Reliable Tool for Analyzing and Monitoring Hematologic Malignancies. International Journal of Molecular Sciences 21: 3141 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7247671/.
Akahoshi Y., Nakasone H., Kawamura K., Kusuda M., Kawamura S., Takeshita J., Yoshino N., Misaki Y., Yoshimura K., Gomyo A., Tanihara A., Tamaki M., Kimura S., Kako S., Kanda Y. (2020): Detection of T315I using digital polymerase chain reaction in allogeneic transplant recipients with Ph-positive acute lymphoblastic anemiain the dasatinib era. Experimental Hematology81, 60 \textendash 67.
Seznam doporučené literatury
Drandi D., Genuardi E., Dogliotti I., Ferrante M., Jiménez C., Guerrini F., Schirico M. L., Mantoan B., Muccio V., Lia G., Zaccaria G. M., Omede P., Passera R., Orsucci L., Benevolo G., Cavallo F., Galimberti S., Sanz R. G., Boccadoro M., Ladetto M., Ferrero S. (2018): Highly sensitive MYD88L265P mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica103, 1029 \textendash 1037.
Cilloni D., Petiti J., Rosso V., Andreani G., Dragani M., Fava C., Saglio G. (2019): Digital PCR in Myeloid Malignancies: Ready to Replace Quantitative PCR? International Journal of Molecular Sciences 20(9): 2249 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6540058/.
Coccaro N., Tota G., Anelli L., Zagaria A., Specchia G., Albano F. (2020): Digital PCR: A Reliable Tool for Analyzing and Monitoring Hematologic Malignancies. International Journal of Molecular Sciences 21: 3141 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7247671/.
Akahoshi Y., Nakasone H., Kawamura K., Kusuda M., Kawamura S., Takeshita J., Yoshino N., Misaki Y., Yoshimura K., Gomyo A., Tanihara A., Tamaki M., Kimura S., Kako S., Kanda Y. (2020): Detection of T315I using digital polymerase chain reaction in allogeneic transplant recipients with Ph-positive acute lymphoblastic anemiain the dasatinib era. Experimental Hematology81, 60 \textendash 67.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Technologie digitální polymerázové řetězové reakce (dPCR) a její využití v hematoonkologii studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponentky. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Škrabišová: Uvedla jste, že u 10 ze 14 pacientů, je známo, jakými mutacemi trpí ti nedetekovaní pacienti?
doc. Luhová: Co obnáší pro pacienta fáze nemoci, kterou nazýváte blastický zvrat?