V posledních letech byl pozorován vysoký úbytek včelstev. Včela je nepostradatelnou
součástí ekosystému, jelikož se účastní opylení rostlin, které je nezbytné
pro rozmnožování některých rostlin. Vymření včel by způsobilo vážné ekologické
i ekonomické problémy, proto je třeba studovat jejich imunitní systém. V teoretické
části této bakalářské práce jsou shrnuty dostupné informace o individuální imunitě včely
medonosné (Apis mellifera) se zaměřením na střevní epitel a antimikrobiální peptidy.
Střevní epitel slouží jako ochranná bariéra před patogeny, které pronikají do těla včel
spolu s potravou. Antimikrobiální peptidy jsou důležitou složkou humorální imunity.
Jejich produkce je aktivována imunitními signálními drahami. Jsou produkovány
hemocyty nebo tukovým tělískem a obsaženy v hemolymfě nebo včelím jedu.
V praktické části byla stanovena koncentrace celkových proteinů ve včelí hemolymfě
Bradfordovou metodou. Dále byla provedena analýza včelí hemolymfy metodou
tricinové polyakrylamidové elektroforézy s přídavkem nebo bez přídavku močoviny
s následným barvením gelu koloidním barvivem Coomassie Brilliant Blue G250.
Proteiny byly přeneseny z gelu na polyvinylidenfluoridovou membránu Western
blottingem. Pro kontrolu správného přenosu proteinů byly membrány barveny
Ponceau S. Antimikrobiální peptidy abaecin, hymenoptaecin a defensin-1 byly následně
imunochemicky detekovány prostřednictvím specifické vazby primárních protilátek a
sekundární protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou. V hemolymfě byly
detekovány abaecin a defensin-1, zatímco hymenoptaecin nebyl detekován. Metody je
třeba dále optimalizovat.
Dále byla testována metoda imunohistochemické detekce abaecinu a defensinu-1
ve vzorcích celých střev. Vzorky byly inkubovány se specifickými primárními
protilátkami a sekundární protilátkou konjugovanou s fluoresceinisothiokyanátem.
Následně byly vzorky pozorovány pod mikroskopem ve viditelném světle
a fluorescenčním spektru. U střev, která byla inkubována s primární protilátkou
pro abaecin nebo defensin-1, byl pozorován fluorescenční signál.
Anotace v angličtině
A high decrease in bee colonies has been observed in recent years. Bees are
an indispensable part of the ecosystem, as they participate in the pollination of plants,
which is essential for the reproduction of some plants. The extinction of bees would
cause serious environmental and economic problems, therefore it is necessary to study
their immune system. The theoretical part of this bachelor thesis summarizes
the available information about individual immunity of the honey bee (Apis mellifera)
with a focus on the intestinal epithelium and antimicrobial peptides. The intestinal
epithelium serves as a protective barrier against pathogens which enter the body of bees
along with food. Antimicrobial peptides are an important component of humoral
immunity. Their production is activated by the imunne signalling pathways. They are
produced by hemocytes or fat body and are contained in hemolymph or bee venom.
In the practical part, total protein concentration in bee hemolymph was determined
by the Bradford method. Furthermore, bee hemolymph was analysed by the method
of tricine polyacrylamide electrophoresis with or without the addition of urea, followed
by staining of the gel with colloidal dye Coomassie Brilliant Blue G250. Proteins were
transferred from the gel to the polyvinylidene fluoride membrane by Western blot.
Membranes were stained with Ponceau S to check for proper protein transfer.
The antimicrobial peptides abaecin, hymenoptaecin and defensin-1 were subsequently
immunochemically detected by specific binding of primary antibodies and secondary
antibody conjugated with alkaline phosphatase. Abaecin and defensin-1 were detected
in the hemolymph, while hymenoptaecin was not detected. The methods need to be
further optimized.
Furthermore, the method of immunohistochemical detection of abaecin and defensin-1
in whole intestinal samples was tested. The samples were incubated with specific
primary antibodies and fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody.
Subsequently, the samples were observed under a microscope in the visible light
and fluorescence spectra. A fluorescent signal was observed in the intestines that were
incubated with the primary antibody for abaecin or defensin-1.
V posledních letech byl pozorován vysoký úbytek včelstev. Včela je nepostradatelnou
součástí ekosystému, jelikož se účastní opylení rostlin, které je nezbytné
pro rozmnožování některých rostlin. Vymření včel by způsobilo vážné ekologické
i ekonomické problémy, proto je třeba studovat jejich imunitní systém. V teoretické
části této bakalářské práce jsou shrnuty dostupné informace o individuální imunitě včely
medonosné (Apis mellifera) se zaměřením na střevní epitel a antimikrobiální peptidy.
Střevní epitel slouží jako ochranná bariéra před patogeny, které pronikají do těla včel
spolu s potravou. Antimikrobiální peptidy jsou důležitou složkou humorální imunity.
Jejich produkce je aktivována imunitními signálními drahami. Jsou produkovány
hemocyty nebo tukovým tělískem a obsaženy v hemolymfě nebo včelím jedu.
V praktické části byla stanovena koncentrace celkových proteinů ve včelí hemolymfě
Bradfordovou metodou. Dále byla provedena analýza včelí hemolymfy metodou
tricinové polyakrylamidové elektroforézy s přídavkem nebo bez přídavku močoviny
s následným barvením gelu koloidním barvivem Coomassie Brilliant Blue G250.
Proteiny byly přeneseny z gelu na polyvinylidenfluoridovou membránu Western
blottingem. Pro kontrolu správného přenosu proteinů byly membrány barveny
Ponceau S. Antimikrobiální peptidy abaecin, hymenoptaecin a defensin-1 byly následně
imunochemicky detekovány prostřednictvím specifické vazby primárních protilátek a
sekundární protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou. V hemolymfě byly
detekovány abaecin a defensin-1, zatímco hymenoptaecin nebyl detekován. Metody je
třeba dále optimalizovat.
Dále byla testována metoda imunohistochemické detekce abaecinu a defensinu-1
ve vzorcích celých střev. Vzorky byly inkubovány se specifickými primárními
protilátkami a sekundární protilátkou konjugovanou s fluoresceinisothiokyanátem.
Následně byly vzorky pozorovány pod mikroskopem ve viditelném světle
a fluorescenčním spektru. U střev, která byla inkubována s primární protilátkou
pro abaecin nebo defensin-1, byl pozorován fluorescenční signál.
Anotace v angličtině
A high decrease in bee colonies has been observed in recent years. Bees are
an indispensable part of the ecosystem, as they participate in the pollination of plants,
which is essential for the reproduction of some plants. The extinction of bees would
cause serious environmental and economic problems, therefore it is necessary to study
their immune system. The theoretical part of this bachelor thesis summarizes
the available information about individual immunity of the honey bee (Apis mellifera)
with a focus on the intestinal epithelium and antimicrobial peptides. The intestinal
epithelium serves as a protective barrier against pathogens which enter the body of bees
along with food. Antimicrobial peptides are an important component of humoral
immunity. Their production is activated by the imunne signalling pathways. They are
produced by hemocytes or fat body and are contained in hemolymph or bee venom.
In the practical part, total protein concentration in bee hemolymph was determined
by the Bradford method. Furthermore, bee hemolymph was analysed by the method
of tricine polyacrylamide electrophoresis with or without the addition of urea, followed
by staining of the gel with colloidal dye Coomassie Brilliant Blue G250. Proteins were
transferred from the gel to the polyvinylidene fluoride membrane by Western blot.
Membranes were stained with Ponceau S to check for proper protein transfer.
The antimicrobial peptides abaecin, hymenoptaecin and defensin-1 were subsequently
immunochemically detected by specific binding of primary antibodies and secondary
antibody conjugated with alkaline phosphatase. Abaecin and defensin-1 were detected
in the hemolymph, while hymenoptaecin was not detected. The methods need to be
further optimized.
Furthermore, the method of immunohistochemical detection of abaecin and defensin-1
in whole intestinal samples was tested. The samples were incubated with specific
primary antibodies and fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody.
Subsequently, the samples were observed under a microscope in the visible light
and fluorescence spectra. A fluorescent signal was observed in the intestines that were
incubated with the primary antibody for abaecin or defensin-1.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Cíle práce:
- Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o složkách a funkci antimikrobiální peptidů (AmP) jako složky humorální imunity hmyzu, se zaměřením na epiteliální imunitu a včelu medonosnou
- Optimalizace metody detekce vybraných AmP ve včelí hemolymfě metodou Western blotting
- Testování metody imunochemické detekce vybraných AmP ve vzorcích včelích střev
Zásady pro vypracování
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Cíle práce:
- Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o složkách a funkci antimikrobiální peptidů (AmP) jako složky humorální imunity hmyzu, se zaměřením na epiteliální imunitu a včelu medonosnou
- Optimalizace metody detekce vybraných AmP ve včelí hemolymfě metodou Western blotting
- Testování metody imunochemické detekce vybraných AmP ve vzorcích včelích střev
Seznam doporučené literatury
Danihlík J., Aronstein, K., Petřivalský M. (2015): Antimicrobial peptides: A key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research. 54, 123-136.
Jefferson J.M., Dolstad H.A., Sivalingam M.D., et al. (2013): :Barrier immune effectors are maintained during transition from nurse to forager in the honey bee. PLOS One 8:e54097. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0054097.
Kwong W.K., Mancenido A.L., Moran N.A. (2017): Immune system stimulation by the native gut microbiota of honey bees. Royal Society Open Science 4: 170003. https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.1098/rsos.170003.
Seznam doporučené literatury
Danihlík J., Aronstein, K., Petřivalský M. (2015): Antimicrobial peptides: A key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research. 54, 123-136.
Jefferson J.M., Dolstad H.A., Sivalingam M.D., et al. (2013): :Barrier immune effectors are maintained during transition from nurse to forager in the honey bee. PLOS One 8:e54097. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0054097.
Kwong W.K., Mancenido A.L., Moran N.A. (2017): Immune system stimulation by the native gut microbiota of honey bees. Royal Society Open Science 4: 170003. https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.1098/rsos.170003.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Studium antimikrobiálních peptidů v epiteliální imunitě včely medonosné studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponentky. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
doc. Luhová: Grafické zpracování gelů, pokud gel neprokazuje zásadní detekci, doporučuji zmenšit velikost obrázku. Je nutné do popisku uvádět veškeré detaily, které nejsou jasné ani z textu, ani z obrázku. V obrázcích je nezbytné uvádět měřítko. Nezapomínejte na negativní kontroly.
dr. Škrabišová: Obrázek č. 7 a 8 - není zřejmé, co znamenají mikrolitry ve spodní části obrázku, prosím, vysvětlete.