Oxid dusnatý (NO) jako významná signální molekula může reagovat s celou řadou reaktivních sloučenin za vzniku reaktivních forem dusíku, které hrají roli v rámci signálních drah NO prostřednictvím posttranslačních modifikací cílových proteinů. Na rozdíl od obratlovců se u bezobratlých nachází pouze vrozená imunita, jejíž součástí je tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku. Signalizace zprostředkovaná NO hraje důležitou roli v obraně hmyzu při infekcích způsobených nejrůznějšími patogeny a NO také působí jako nespecifická cytotoxická molekula, kdy jeho přeměnou vznikají reaktivní molekuly, které se podílí na poškození DNA, proteinů a lipidů.
V teoretické části diplomové práce jsou shrnuty aktuální znalosti o funkci NO v rámci metabolismu a imunitního systému hmyzu. Jsou zde také popsány enzymové i neenzymové mechanismy vzniku NO a jeho reaktivita.
V experimentální části byly na vzorcích včely medonosné a octomilky obecné testovány metody stanovení aktivit enzymů - thioredoxinreduktasy (TrxR), NO synthasy (NOS) a S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR). Dále byly studovány změny metabolismu NO při vystavení včel modelovým patogenům. Metodou Western blotting s následnou imunochemickou detekcí proteinů byly testovány dvě protilátky - králičí polyklonální anti-GSNOR a univerzální anti-NOS a byly optimalizovány podmínky jejich použití.
Anotace v angličtině
Nitric oxide (NO) as an important signaling molecule can react with a variety of reactive compounds to form reactive nitrogen species that play a role in NO signaling pathways through posttranslational modifications of target proteins. Unlike vertebrates, invertebrates have only innate immunity, which includes the production of reactive oxygen and nitrogen species. NO-mediated signaling plays an important role in insect defense in infections caused by a variety of pathogens, and NO also acts as a nonspecific cytotoxic molecule, transforming reactive molecules that contribute to DNA, protein, and lipid damage.
The theoretical part of the thesis summarizes the current knowledge about the function of NO in the metabolism and immune system of insects. Both enzymatic and nonenzymatic mechanisms of NO formation and its reactivity are also described. In the experimental part, methods for determining the activities of enzymes - thioredoxin reductase (TrxR), NO synthase (NOS) and S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) were tested on samples of honeybees and fruit flies. Furthermore, changes in NO metabolism during exposure of bees to model pathogens were studied. Two antibodies were tested by Western blotting followed by immunochemical detection of proteins - rabbit polyclonal anti-GSNOR and universal anti-NOS and the conditions of their use were optimized.
Oxid dusnatý (NO) jako významná signální molekula může reagovat s celou řadou reaktivních sloučenin za vzniku reaktivních forem dusíku, které hrají roli v rámci signálních drah NO prostřednictvím posttranslačních modifikací cílových proteinů. Na rozdíl od obratlovců se u bezobratlých nachází pouze vrozená imunita, jejíž součástí je tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku. Signalizace zprostředkovaná NO hraje důležitou roli v obraně hmyzu při infekcích způsobených nejrůznějšími patogeny a NO také působí jako nespecifická cytotoxická molekula, kdy jeho přeměnou vznikají reaktivní molekuly, které se podílí na poškození DNA, proteinů a lipidů.
V teoretické části diplomové práce jsou shrnuty aktuální znalosti o funkci NO v rámci metabolismu a imunitního systému hmyzu. Jsou zde také popsány enzymové i neenzymové mechanismy vzniku NO a jeho reaktivita.
V experimentální části byly na vzorcích včely medonosné a octomilky obecné testovány metody stanovení aktivit enzymů - thioredoxinreduktasy (TrxR), NO synthasy (NOS) a S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR). Dále byly studovány změny metabolismu NO při vystavení včel modelovým patogenům. Metodou Western blotting s následnou imunochemickou detekcí proteinů byly testovány dvě protilátky - králičí polyklonální anti-GSNOR a univerzální anti-NOS a byly optimalizovány podmínky jejich použití.
Anotace v angličtině
Nitric oxide (NO) as an important signaling molecule can react with a variety of reactive compounds to form reactive nitrogen species that play a role in NO signaling pathways through posttranslational modifications of target proteins. Unlike vertebrates, invertebrates have only innate immunity, which includes the production of reactive oxygen and nitrogen species. NO-mediated signaling plays an important role in insect defense in infections caused by a variety of pathogens, and NO also acts as a nonspecific cytotoxic molecule, transforming reactive molecules that contribute to DNA, protein, and lipid damage.
The theoretical part of the thesis summarizes the current knowledge about the function of NO in the metabolism and immune system of insects. Both enzymatic and nonenzymatic mechanisms of NO formation and its reactivity are also described. In the experimental part, methods for determining the activities of enzymes - thioredoxin reductase (TrxR), NO synthase (NOS) and S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) were tested on samples of honeybees and fruit flies. Furthermore, changes in NO metabolism during exposure of bees to model pathogens were studied. Two antibodies were tested by Western blotting followed by immunochemical detection of proteins - rabbit polyclonal anti-GSNOR and universal anti-NOS and the conditions of their use were optimized.
Vypracovat literární rešerši aktuálních znalostí o funkci oxidu dusnatého v imunitě hmyzu, se zaměřením na úlohu oxidu dusnatého v interakcích hmyzu s virovými, bakteriálními a houbovými patogeny.Testování metod stanovení enzymů ve vzorcích hmyzu a dále studium změn metabolismu oxidu dusnatého při vystavení včel modelovým patogenům.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisi v den obhajoby.
Zásady pro vypracování
Vypracovat literární rešerši aktuálních znalostí o funkci oxidu dusnatého v imunitě hmyzu, se zaměřením na úlohu oxidu dusnatého v interakcích hmyzu s virovými, bakteriálními a houbovými patogeny.Testování metod stanovení enzymů ve vzorcích hmyzu a dále studium změn metabolismu oxidu dusnatého při vystavení včel modelovým patogenům.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisi v den obhajoby.
Seznam doporučené literatury
Foley E., O'Farrell P.H (2003) Nitric oxide contributes to induction of innate immune responses to gram-negative bacteria in Drosophila. Genes and Development 17, 115-25.
Eleftherianos I et al. (2014) Nitric oxide levels regulate the immune response of Drosophila melanogaster reference laboratory strains to bacterial infections. Infection and Immunology 82, 4169-81.
Mioto P.T et al. (2017) Alternative fluorimetric-based method to detect and compare total S-nitrosothiols in plants. Nitric Oxide 68, 7-13.
Sadekuzzaman Md et al. (2018) Nitric Oxide Mediates Insect Cellular Immunity via Phospholipase A2 Activation. Journal of Innate Immunity 10, 70-81.
Das De T. et al. (2018) Interorgan Molecular Communication Strategies of "Local" and "Systemic" Innate Immune Responses in Mosquito Anopheles stephensi. Frontiers in Immunology 9, 148.
Seznam doporučené literatury
Foley E., O'Farrell P.H (2003) Nitric oxide contributes to induction of innate immune responses to gram-negative bacteria in Drosophila. Genes and Development 17, 115-25.
Eleftherianos I et al. (2014) Nitric oxide levels regulate the immune response of Drosophila melanogaster reference laboratory strains to bacterial infections. Infection and Immunology 82, 4169-81.
Mioto P.T et al. (2017) Alternative fluorimetric-based method to detect and compare total S-nitrosothiols in plants. Nitric Oxide 68, 7-13.
Sadekuzzaman Md et al. (2018) Nitric Oxide Mediates Insect Cellular Immunity via Phospholipase A2 Activation. Journal of Innate Immunity 10, 70-81.
Das De T. et al. (2018) Interorgan Molecular Communication Strategies of "Local" and "Systemic" Innate Immune Responses in Mosquito Anopheles stephensi. Frontiers in Immunology 9, 148.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Funkce oxidu dusnatého v signálních drahách vrozené imunity hmyzu studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku vedoucího i oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Sekaninová: Máte nějaké vysvětlení, proč použitý inhibitor NOS nefungoval? Zkoušeli jsme i jiné koncentrace nebo jiný inhibitor?
dr. Škrabišová: Existují další potenciální inhibitory, které byste mohla použít?
prof. Šebela: Já bych měl připomínku k používání názvu stanovení proteinů, správně je dle Bradforda.