Tato diplomová práce se zabývá molekulárně genetickou charakteristikou českých izolátů Pea necrotic yellow dwarf virus (PNYDV), zástupce rodu Nanovirus, čeledi Nanoviridae.
Teoretická část shrnuje obecné znalosti jak o čeledi Nanoviridae, jejich morfologii, biologických vlastnostech a organizaci genomu, ale také se detailněji zaměřuje na popis viru pea necrotic yellow dwarf virus samotného. Závěrem shrnuje obecné poznatky o rekombinacích a přeskupování genomu u ssDNA virů.
Praktická část se soustředí na popis genomu získaných virových izolátů. Nejdříve se zabývá detekcí a amplifikací jednotlivých genomových segmentů u 26 českých izolátů PNYDV. Sangerovým sekvenováním byly získány parciální sekvence DNA-C, -M, -N, -R, -S, -U2 a -U4 o délce 861-939 bp, nepodařilo se amplifikovat segment DNA-U1. Byly identifikovány a charakterizovány základní motivy v genomových segmentech PNYDV (kmenová smyčka, replikační počátek, TATA box a polyadenylační signál) a byly identifikovány významné změny v jejich struktuře. Mutace se ve většině případů vyskytovaly pouze v nekódujících oblastech, v oblasti kódující byly mutace pouze výjimkou či se jednalo o synonymní mutace. Genetickou a fylogenetickou analýzou pomocí neighbor-joining metody bylo zjištěno, že jednotlivé genomové segmenty tvoří silně homogenní skupiny a jejich variabilita je celkově velmi nízká. České izoláty PNYDV se od evropských izolátů téměř nelišily. V rámci všech známých izolátů PNYDV bylo identifikováno 7 rekombinantních událostí, z toho pět rekombinantních segmentů (mezi DNA-C a -N; DNA-N a -C; DNA-U4 a -N) bylo detekováno u českých PNYDV izolátů. Je také diskutována epidemiologie viru a možnost jeho dalšího šíření v ČR a Evropě.
Anotace v angličtině
This diploma thesis deals with molecular and genetic characterisation of Czech isolates of Pea necrotic yellow dwarf virus (PNYDV), a representative of the genus Nanovirus, family Nanoviridae.
The theoretical part summarizes general knowledge about family Nanoviridae, its morphology, biological characteristics and genome organization, but it also focuses on the description of the pea necrotic yellow dwarf virus itself in detail. Finally, it summarizes the general knowledge about recombination and genetic reassortments of ssDNA viruses.
The experimental part focuses on the description of the genome of obtained viral isolates. Firstly, it deals with the detection and amplification of genomic segments in 26 Czech PNYDV isolates. Partial sequences of DNA-C, -M, -N, -R, -S, -U2 and -U4 of 861-939 bp in leght were obtainen by Sanger sequencing. It failed to amplify DNA-U1 segment. The basic motifs in the PNYDV genomic segments (stem loop, origin of replication, TATA box and polyadenylation signal) were identified and characterized, and significant changes in their structure were detected. In most cases, the mutations occurred only in the non-coding regions, in the coding region the mutations were only an exception or were synonymous mutations. Gentic and phylogenetic analysis using the neighbour-joining method revealed that the individual genomic segments form strongly homogeneous groups and the variability is very low. Czech PNYDV isolates were almost identical from European isolates. Within all known PNYDV isolates, 7 recombinant events were identified, of which five recombinant segments (between DNA-C and -N; DNA-N and -C; DNA-U4 and -N) were detected in Czech PNYDV solates. The epidemiology of the virus and the possibility of its further spread in the Czech Republic and Europe are also discussed.
Tato diplomová práce se zabývá molekulárně genetickou charakteristikou českých izolátů Pea necrotic yellow dwarf virus (PNYDV), zástupce rodu Nanovirus, čeledi Nanoviridae.
Teoretická část shrnuje obecné znalosti jak o čeledi Nanoviridae, jejich morfologii, biologických vlastnostech a organizaci genomu, ale také se detailněji zaměřuje na popis viru pea necrotic yellow dwarf virus samotného. Závěrem shrnuje obecné poznatky o rekombinacích a přeskupování genomu u ssDNA virů.
Praktická část se soustředí na popis genomu získaných virových izolátů. Nejdříve se zabývá detekcí a amplifikací jednotlivých genomových segmentů u 26 českých izolátů PNYDV. Sangerovým sekvenováním byly získány parciální sekvence DNA-C, -M, -N, -R, -S, -U2 a -U4 o délce 861-939 bp, nepodařilo se amplifikovat segment DNA-U1. Byly identifikovány a charakterizovány základní motivy v genomových segmentech PNYDV (kmenová smyčka, replikační počátek, TATA box a polyadenylační signál) a byly identifikovány významné změny v jejich struktuře. Mutace se ve většině případů vyskytovaly pouze v nekódujících oblastech, v oblasti kódující byly mutace pouze výjimkou či se jednalo o synonymní mutace. Genetickou a fylogenetickou analýzou pomocí neighbor-joining metody bylo zjištěno, že jednotlivé genomové segmenty tvoří silně homogenní skupiny a jejich variabilita je celkově velmi nízká. České izoláty PNYDV se od evropských izolátů téměř nelišily. V rámci všech známých izolátů PNYDV bylo identifikováno 7 rekombinantních událostí, z toho pět rekombinantních segmentů (mezi DNA-C a -N; DNA-N a -C; DNA-U4 a -N) bylo detekováno u českých PNYDV izolátů. Je také diskutována epidemiologie viru a možnost jeho dalšího šíření v ČR a Evropě.
Anotace v angličtině
This diploma thesis deals with molecular and genetic characterisation of Czech isolates of Pea necrotic yellow dwarf virus (PNYDV), a representative of the genus Nanovirus, family Nanoviridae.
The theoretical part summarizes general knowledge about family Nanoviridae, its morphology, biological characteristics and genome organization, but it also focuses on the description of the pea necrotic yellow dwarf virus itself in detail. Finally, it summarizes the general knowledge about recombination and genetic reassortments of ssDNA viruses.
The experimental part focuses on the description of the genome of obtained viral isolates. Firstly, it deals with the detection and amplification of genomic segments in 26 Czech PNYDV isolates. Partial sequences of DNA-C, -M, -N, -R, -S, -U2 and -U4 of 861-939 bp in leght were obtainen by Sanger sequencing. It failed to amplify DNA-U1 segment. The basic motifs in the PNYDV genomic segments (stem loop, origin of replication, TATA box and polyadenylation signal) were identified and characterized, and significant changes in their structure were detected. In most cases, the mutations occurred only in the non-coding regions, in the coding region the mutations were only an exception or were synonymous mutations. Gentic and phylogenetic analysis using the neighbour-joining method revealed that the individual genomic segments form strongly homogeneous groups and the variability is very low. Czech PNYDV isolates were almost identical from European isolates. Within all known PNYDV isolates, 7 recombinant events were identified, of which five recombinant segments (between DNA-C and -N; DNA-N and -C; DNA-U4 and -N) were detected in Czech PNYDV solates. The epidemiology of the virus and the possibility of its further spread in the Czech Republic and Europe are also discussed.
1. Shrnutí aktuálních poznatků o genomu a genetické struktuře nanovirů s důrazem na Pea necrotic yellow dwarf virus.
2. Izolace DNA z rostlinného materiálu, detekce a PCR amplifikace genomických fragmentů PNYDV, jejich sekvenování.
3. Bioinformatická analýza sekvenčních dat; genetická, rekombinantní analýza detekovaných izolátů a jejich genomických částí.
4. Fylogenetická analýza českých izolátů v kontextu evoluce PNYDV a evoluce nanovirů.
Zásady pro vypracování
1. Shrnutí aktuálních poznatků o genomu a genetické struktuře nanovirů s důrazem na Pea necrotic yellow dwarf virus.
2. Izolace DNA z rostlinného materiálu, detekce a PCR amplifikace genomických fragmentů PNYDV, jejich sekvenování.
3. Bioinformatická analýza sekvenčních dat; genetická, rekombinantní analýza detekovaných izolátů a jejich genomických částí.
4. Fylogenetická analýza českých izolátů v kontextu evoluce PNYDV a evoluce nanovirů.
Seznam doporučené literatury
Gaafar et al.(2016) Vicia faba, V. sativa and Lensculinaris as new hosts for Pea necrotic yellow dwarf virus in Germany and Austria. New Disease Reports 34, 28.
Gaafar et al. (2017) First report of Pea necrotic yellow dwarf virus in The Netherlands. New Disease Reports 35, 23.
Grigoras et al. (2014) Genome diversity and evidence of recombination and reassortment in nanoviruses from Europe. Journal of General Virology 95(5): 1178-1191.
Grigoras et al. (2010) High Variability and Rapid Evolution of a Nanovirus. Journal of Virology 84 (18) 9105-9117
Gronenborn B. (2004) Nanoviruses: genome organisation and protein function. Vet Microbiol. 98(2):103-109.
Sicard A. et al. (2015) Circulative Nonpropagative Aphid Transmission of Nanoviruses: an Oversimplified View. Journal of Virology 89(19): 9719-26
Seznam doporučené literatury
Gaafar et al.(2016) Vicia faba, V. sativa and Lensculinaris as new hosts for Pea necrotic yellow dwarf virus in Germany and Austria. New Disease Reports 34, 28.
Gaafar et al. (2017) First report of Pea necrotic yellow dwarf virus in The Netherlands. New Disease Reports 35, 23.
Grigoras et al. (2014) Genome diversity and evidence of recombination and reassortment in nanoviruses from Europe. Journal of General Virology 95(5): 1178-1191.
Grigoras et al. (2010) High Variability and Rapid Evolution of a Nanovirus. Journal of Virology 84 (18) 9105-9117
Gronenborn B. (2004) Nanoviruses: genome organisation and protein function. Vet Microbiol. 98(2):103-109.
Sicard A. et al. (2015) Circulative Nonpropagative Aphid Transmission of Nanoviruses: an Oversimplified View. Journal of Virology 89(19): 9719-26
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Kateřiny Neumanové zahájil prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucí práce Mgr. Dany Šafářové, Ph.D. a oponenta prof. RNDr. Milana Navrátila, CSc.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- Pea necrotic yellow dwarf virus - charakteristika, symptomy, přenašeči, výskyt, směsné infekce
- Experimentální provedení práce
- Analýza nukleotidové a aminokyselinové variability, rekombinantní analýza
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Vysvětlení perzistentního cirkulativního nepropagativního a propagativního přenosu, a neperzistentního přenosu
- příčiny různě úspěšné amplifikace jednotlivých genomových segmentů viru
- Situování pozice konce místa rekombinace ve výsledku rekombinantní analýzy mimo 99% interval spolehlivosti.
- Výsledky této diplomové práce a práce Grigoras et al.
- Detekce vnitrodruhové a mezidruhové hybridizace u studovaného viru, vstupní data pro rekombinantní analýzu
- Možnosti inhibice či zničení studovaného viru v rostlině
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala věcně, pohotově a přiměřeně.