Tato diplomová práce se zabývá syntézou a biologickou charakterizací peptidů s potenciálními antimikrobiálními vlastnostmi. V teoretické části jsou shrnuty základní vlastnosti antimikrobiálních peptidů, mechanismus jejich působení, funkce a zástupci. Dále je zde stručně popsáno získávání peptidů a zvláště pak metoda syntézy peptidů na pevné fázi. Experimentální část je zaměřena na přípravu látek, jejich charakterizaci dostupnými fyzikálně-chemickými metodami a biologickou analýzu. Při stanovení proteolytické stability bylo zjištěno, že peptidy obsahující v sekvenci D-aminokyseliny nejsou štěpeny enzymem trypsinem. Dále byla stanovena hodnota minimální inhibiční koncentrace peptidů pro bakterie Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus. Pro stanovení cytotoxicity vůči savčím buňkám byly využity myší dermální fibroblasty. U některých peptidů byly prokázány koncentrace, které působí toxicky vůči bakteriálním buňkám, ale jsou zároveň netoxické vůči savčím. Další charakterizací bylo definování hemolytické aktivity s využitím lidské krve a v poslední řadě byly vybrané peptidy také testovány pro svou anti-biofilmovou aktivitu. Získané výsledky napovídají tomu, že struktura a vlastnosti peptidů hrají významnou roli při definování jejich antimikrobiální aktivity a že mohou tyto látky působit jako významná alternativa v boji proti bakteriálním onemocněním.
Anotace v angličtině
The main topic of this diploma thesis is synthesis and biological characterization of potentially antimicrobial peptides. In the theoretical part, main features of antimicrobial peptides (AMPs) are introduced including mechanism of action, function and specimen of AMPs. Furthermore, methods of AMPs extraction are described with a focus on solid-phase peptic synthesis. Within materials and methods, detailed protocols of peptide synthesis and their biological examination are provided. Examination of proteolytic stability of the synthetized peptides indicated, that peptides with a D-amino acids in their sequence are not susceptible to cleavage by trypsin. Moreover, minimum inhibitory concentration values against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus bacteria were determined. Subsequently, mouse dermal fibroblasts were used for mammalian cytotoxicity measurement. For certain concentrations, some peptides displayed both effective bacterial killing and no mammalian toxicity. Hemolytic activity was assayed by using human blood and additionally anti-biofilm activity assessment was conducted as well. Findings of this research suggest that structure and properties are crucial in determination of peptide antimicrobial effects and support the idea of potential use of peptides in bacterial infection treatment.
Tato diplomová práce se zabývá syntézou a biologickou charakterizací peptidů s potenciálními antimikrobiálními vlastnostmi. V teoretické části jsou shrnuty základní vlastnosti antimikrobiálních peptidů, mechanismus jejich působení, funkce a zástupci. Dále je zde stručně popsáno získávání peptidů a zvláště pak metoda syntézy peptidů na pevné fázi. Experimentální část je zaměřena na přípravu látek, jejich charakterizaci dostupnými fyzikálně-chemickými metodami a biologickou analýzu. Při stanovení proteolytické stability bylo zjištěno, že peptidy obsahující v sekvenci D-aminokyseliny nejsou štěpeny enzymem trypsinem. Dále byla stanovena hodnota minimální inhibiční koncentrace peptidů pro bakterie Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus. Pro stanovení cytotoxicity vůči savčím buňkám byly využity myší dermální fibroblasty. U některých peptidů byly prokázány koncentrace, které působí toxicky vůči bakteriálním buňkám, ale jsou zároveň netoxické vůči savčím. Další charakterizací bylo definování hemolytické aktivity s využitím lidské krve a v poslední řadě byly vybrané peptidy také testovány pro svou anti-biofilmovou aktivitu. Získané výsledky napovídají tomu, že struktura a vlastnosti peptidů hrají významnou roli při definování jejich antimikrobiální aktivity a že mohou tyto látky působit jako významná alternativa v boji proti bakteriálním onemocněním.
Anotace v angličtině
The main topic of this diploma thesis is synthesis and biological characterization of potentially antimicrobial peptides. In the theoretical part, main features of antimicrobial peptides (AMPs) are introduced including mechanism of action, function and specimen of AMPs. Furthermore, methods of AMPs extraction are described with a focus on solid-phase peptic synthesis. Within materials and methods, detailed protocols of peptide synthesis and their biological examination are provided. Examination of proteolytic stability of the synthetized peptides indicated, that peptides with a D-amino acids in their sequence are not susceptible to cleavage by trypsin. Moreover, minimum inhibitory concentration values against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus bacteria were determined. Subsequently, mouse dermal fibroblasts were used for mammalian cytotoxicity measurement. For certain concentrations, some peptides displayed both effective bacterial killing and no mammalian toxicity. Hemolytic activity was assayed by using human blood and additionally anti-biofilm activity assessment was conducted as well. Findings of this research suggest that structure and properties are crucial in determination of peptide antimicrobial effects and support the idea of potential use of peptides in bacterial infection treatment.
1) Vypracování literární rešerše na téma metody syntézy peptidů, využití syntetických peptidů, antimikrobiální peptidy. 2) Syntéza vybraných peptidů manuálně metodou na pevné fázi, jejich purifikace a charakterizace dostupnými fyzikálně-chemickými metodami. 3) Testování antimikrobiální účinnosti vybraných peptidů syntetizovaných v předchozím kroku na Gram+/Gram- bakterie. 4) Testování cytotoxicity těchto peptidů na savčí buňky (MTT, hemolýza).
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Zásady pro vypracování
1) Vypracování literární rešerše na téma metody syntézy peptidů, využití syntetických peptidů, antimikrobiální peptidy. 2) Syntéza vybraných peptidů manuálně metodou na pevné fázi, jejich purifikace a charakterizace dostupnými fyzikálně-chemickými metodami. 3) Testování antimikrobiální účinnosti vybraných peptidů syntetizovaných v předchozím kroku na Gram+/Gram- bakterie. 4) Testování cytotoxicity těchto peptidů na savčí buňky (MTT, hemolýza).
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Seznam doporučené literatury
Merrifield, R. B., Solid phase synthesis. Science 1986, 232 (4748), 341-347. Coin, I.; Beyermann, M.; Bienert, M., Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols 2007, 2 (12), 3247-3256. Zhu, M.; Liu, P.; Niu, Z.-W., A perspective on general direction and challenges facing antimicrobial peptides. Chin. Chem. Lett. 2017, 28 (4), 703-708. Zhang, L. J.; Gallo, R. L., Antimicrobial peptides. Curr. Biol. 2016, 26 (1), R14-9. Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, Volume 6, Issue 2. 2016. Pages 71-79.
Seznam doporučené literatury
Merrifield, R. B., Solid phase synthesis. Science 1986, 232 (4748), 341-347. Coin, I.; Beyermann, M.; Bienert, M., Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols 2007, 2 (12), 3247-3256. Zhu, M.; Liu, P.; Niu, Z.-W., A perspective on general direction and challenges facing antimicrobial peptides. Chin. Chem. Lett. 2017, 28 (4), 703-708. Zhang, L. J.; Gallo, R. L., Antimicrobial peptides. Curr. Biol. 2016, 26 (1), R14-9. Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, Volume 6, Issue 2. 2016. Pages 71-79.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího diplomové práce a oponentky studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Ve veřejné diskusi dotaz položen nebyl.