Teoretická časť diplomovej práce obsahuje literárnu rešerš na tému antimikrobiálne peptidy a ich diverzitu, mechanizmus účinku a bakteriálnu rezistenciu s následným zameraním na ľudský antimikrobiálny peptid katelicidín LL-37. Okrem toho sú v teoretickej časti popísané štruktúry, ktoré môžeme nájsť v endosperme jačmeňa, ako sú napríklad vakuoly skladujúce proteíny alebo proteínové telieska. V poslednej časti sú popísané rôzne rastlinné heterológne expresné systémy na báze listov a semien, so zameraním na ich výhody a nevýhody použitia a purifikačné stratégie rôznych rekombinantných proteínov využívajúce afinitné značky alebo nechromatografické metódy.
V experimentálnej časti diplomovej práce bola najprv overená funkčnosť signálneho peptidu legumínu B4 vo fúzii s GFP sekvenciou pomocou tranzientnej expresie v listoch tabaku a ich následným pozorovaním pod fluorescenčným a konfokálnym mikroskopom. Okrem toho boli dva konštrukty obsahujúce ľudský katelicidín LL-37 spolu s ďalšími fúznymi značkami klonované najprv do vstupného vektora pENTR1A_Hana a následne pomocou GATEWAY rekombinantnej technológie do expresného vektora pBract209, vhodného na expresiu v endosperme jačmeňa. Vrámci testovania a overovania expresie a možností purifikácie katelicidinových proteínových fúzií bol vybraný konštrukt PMK-RQ:LL-37 S8 a s týmto bola uskutočnená tranzientná expresia v listoch tabaku. Nakoniec bola táto stratégia zatransformovaná pomocou baktérie Agrobacterium tumefaciens do listov tabaku a následne purifikovaná využitím fúznych značiek DAMP4 a y-zeín. Optimalizovaný bol krok extrakcie a následný purifikačný krok pomocou teplotného alebo etanolového zrážania proteínov. Purifikačné kroky boli v tejto práci vyhodnocované pomocou metódy Western blot za použitia anti-LL-37 protilátky.
Anotace v angličtině
The theoretical part of the diploma thesis contains a review of existing literature on the topic of antimicrobial peptides and their diversity, mechanism of action, and bacterial resistance with a subsequent focus on the human antimicrobial peptide cathelicidin LL-37. Also, the theoretical part describes the structures that can be found in the barley endosperm, such as protein storage vacuoles or protein bodies. The last part describes various plant heterologous expression systems based on leaves and seeds, focusing on their advantages and disadvantages of use and purification strategies of various recombinant proteins using affinity tags or non-chromatographic methods.
In the experimental part of the diploma thesis, the functionality of the signal peptide legumin B4 fused with the GFP sequence was first verified by transient expression in tobacco leaves and their subsequent observation under fluorescence and confocal microscope. Besides, two constructs containing human cathelicidin LL-37 together with other fusion tags were first cloned into the entry vector pENTR1A_Hana and then using GATEWAY recombinant technology into the expression vector pBract209, suitable for expression in barley endosperm. As a part of testing and verification of expression and purification possibilities of cathelicidin protein fusions, the construct PMK-RQ:LL-37 S8 was chosen and with this construct transient expression was performed in tobacco leaves. Finally, this strategy was transformed into tobacco leaves using Agrobacterium tumefaciens and subsequently purified using the DAMP4 and y-zein fusion proteins. The extraction step and the subsequent purification step by thermal or ethanol protein precipitations were optimized. All purification steps were evaluated by means of Western blotting using anti-LL-37 antibody.
Klíčová slova
LL-37, GFP, tabak, jačmeň, DAMP4, y-zein, LeB4
Klíčová slova v angličtině
LL-37, GFP, tobacco, barley, DAMP4, y-zein, LeB4
Rozsah průvodní práce
85 s. (174 112 znakov).
Jazyk
SK
Anotace
Teoretická časť diplomovej práce obsahuje literárnu rešerš na tému antimikrobiálne peptidy a ich diverzitu, mechanizmus účinku a bakteriálnu rezistenciu s následným zameraním na ľudský antimikrobiálny peptid katelicidín LL-37. Okrem toho sú v teoretickej časti popísané štruktúry, ktoré môžeme nájsť v endosperme jačmeňa, ako sú napríklad vakuoly skladujúce proteíny alebo proteínové telieska. V poslednej časti sú popísané rôzne rastlinné heterológne expresné systémy na báze listov a semien, so zameraním na ich výhody a nevýhody použitia a purifikačné stratégie rôznych rekombinantných proteínov využívajúce afinitné značky alebo nechromatografické metódy.
V experimentálnej časti diplomovej práce bola najprv overená funkčnosť signálneho peptidu legumínu B4 vo fúzii s GFP sekvenciou pomocou tranzientnej expresie v listoch tabaku a ich následným pozorovaním pod fluorescenčným a konfokálnym mikroskopom. Okrem toho boli dva konštrukty obsahujúce ľudský katelicidín LL-37 spolu s ďalšími fúznymi značkami klonované najprv do vstupného vektora pENTR1A_Hana a následne pomocou GATEWAY rekombinantnej technológie do expresného vektora pBract209, vhodného na expresiu v endosperme jačmeňa. Vrámci testovania a overovania expresie a možností purifikácie katelicidinových proteínových fúzií bol vybraný konštrukt PMK-RQ:LL-37 S8 a s týmto bola uskutočnená tranzientná expresia v listoch tabaku. Nakoniec bola táto stratégia zatransformovaná pomocou baktérie Agrobacterium tumefaciens do listov tabaku a následne purifikovaná využitím fúznych značiek DAMP4 a y-zeín. Optimalizovaný bol krok extrakcie a následný purifikačný krok pomocou teplotného alebo etanolového zrážania proteínov. Purifikačné kroky boli v tejto práci vyhodnocované pomocou metódy Western blot za použitia anti-LL-37 protilátky.
Anotace v angličtině
The theoretical part of the diploma thesis contains a review of existing literature on the topic of antimicrobial peptides and their diversity, mechanism of action, and bacterial resistance with a subsequent focus on the human antimicrobial peptide cathelicidin LL-37. Also, the theoretical part describes the structures that can be found in the barley endosperm, such as protein storage vacuoles or protein bodies. The last part describes various plant heterologous expression systems based on leaves and seeds, focusing on their advantages and disadvantages of use and purification strategies of various recombinant proteins using affinity tags or non-chromatographic methods.
In the experimental part of the diploma thesis, the functionality of the signal peptide legumin B4 fused with the GFP sequence was first verified by transient expression in tobacco leaves and their subsequent observation under fluorescence and confocal microscope. Besides, two constructs containing human cathelicidin LL-37 together with other fusion tags were first cloned into the entry vector pENTR1A_Hana and then using GATEWAY recombinant technology into the expression vector pBract209, suitable for expression in barley endosperm. As a part of testing and verification of expression and purification possibilities of cathelicidin protein fusions, the construct PMK-RQ:LL-37 S8 was chosen and with this construct transient expression was performed in tobacco leaves. Finally, this strategy was transformed into tobacco leaves using Agrobacterium tumefaciens and subsequently purified using the DAMP4 and y-zein fusion proteins. The extraction step and the subsequent purification step by thermal or ethanol protein precipitations were optimized. All purification steps were evaluated by means of Western blotting using anti-LL-37 antibody.
Klíčová slova
LL-37, GFP, tabak, jačmeň, DAMP4, y-zein, LeB4
Klíčová slova v angličtině
LL-37, GFP, tobacco, barley, DAMP4, y-zein, LeB4
Zásady pro vypracování
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
1) Vypracovanie literárnej rešerše na tému antimikrobiálne peptidy a produkčné stratégie pre prípravu rekombinantných proteínov v endosperme jačmeňa 2) Klonovanie konštruktov pre expresiu ľudského katelicidínu LL-37 v tabaku a v jačmeni 3) Testovanie pripravených konštruktov pomocou tranzientnej expresie v listoch tabaku; optimalizácia purifikačnej stratégie rekombinantného produktu a následné testovanie antimikrobiálnej aktivity 4) Testovanie signálnych sekvencií použitých v katelicidinových konštruktoch pomocou fúzie s GFP proteínom a lokalizácia v rastlinách tabaku a jačmeňa 5) Transformácia embryí jačmeňa katelicidinovými konštruktmi
Zásady pro vypracování
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
1) Vypracovanie literárnej rešerše na tému antimikrobiálne peptidy a produkčné stratégie pre prípravu rekombinantných proteínov v endosperme jačmeňa 2) Klonovanie konštruktov pre expresiu ľudského katelicidínu LL-37 v tabaku a v jačmeni 3) Testovanie pripravených konštruktov pomocou tranzientnej expresie v listoch tabaku; optimalizácia purifikačnej stratégie rekombinantného produktu a následné testovanie antimikrobiálnej aktivity 4) Testovanie signálnych sekvencií použitých v katelicidinových konštruktoch pomocou fúzie s GFP proteínom a lokalizácia v rastlinách tabaku a jačmeňa 5) Transformácia embryí jačmeňa katelicidinovými konštruktmi
Seznam doporučené literatury
Zasloff M. (2002): Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389?395.
Bridle A., Nosworthy E., Polinski M., Nowak B. (2011): Evidence of an Antimicrobial-Immunomodulatory Role of Atlantic Salmon Cathelicidins during Infection with Yersinia ruckeri. PLoS ONE6, 8.
Kościuczuk E. M., Lisowski P., Jarczak J., Strzałkowska N., Jóźwik A., Horbańczuk J., Krzyżewski J., Zwierzchowski L., Bagnicka E. (2012): Cathelicidins: family of antimicrobial peptides. A review. Molecular biology reports39(12), 10957?10970.
Wilken L. R., Nikolov Z. L. (2012): Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnology Advances 30(2), 419-433.
Seznam doporučené literatury
Zasloff M. (2002): Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389?395.
Bridle A., Nosworthy E., Polinski M., Nowak B. (2011): Evidence of an Antimicrobial-Immunomodulatory Role of Atlantic Salmon Cathelicidins during Infection with Yersinia ruckeri. PLoS ONE6, 8.
Kościuczuk E. M., Lisowski P., Jarczak J., Strzałkowska N., Jóźwik A., Horbańczuk J., Krzyżewski J., Zwierzchowski L., Bagnicka E. (2012): Cathelicidins: family of antimicrobial peptides. A review. Molecular biology reports39(12), 10957?10970.
Wilken L. R., Nikolov Z. L. (2012): Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnology Advances 30(2), 419-433.
Přílohy volně vložené
2xCD
Přílohy vázané v práci
ilustrace, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Využitie bioenkapsulácie pre produkciu katelicidínu LL-37 v endosperme jačmeňa studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku vedoucího i oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
doc. Lenka Luhová: Proč se věnujete strategii vkládat a připravit si tento peptid?
dr. Mária Škrabišová: Proč jste nepoužili pozitivní kontrolu pro vizualizaci v ER?
dr. David Zalabák: Proč jste si vybrali zrovna ER?
Známka navrhovaná: A, C, známka udělená: C.
Zdůvodnění: Komise se přiklonila k návrhu oponentky.