Tato diplomová práce se zabývá klonováním, purifikací a charakterizací ječmenné a kukuřičné aldehyddehydrogenasy rodiny 22 (ALDH22), což je nově objevená rodina a nebyla zatím dostatečně prozkoumána. Byla provedena fylogenetická analýza ALDH22, tento protein byl popsán u řas i suchozemských rostlin, tudíž se vyvinul již před přechodem rostlin z vody na souš, navíc byl přítomen u většiny dostupných organismů. V experimentální části byl gen pro ALDH22 z vybraných pletiv vložen do expresních bakterií Escherichia coli, z jejichž lyzátu byl protein pomocí afinitivní a iontoměničové chromatografie purifikován. Bylo stanoveno pH optimum, substrátová specifita a kinetické parametry Km a Vlim vybraných substrátů, u nichž byla porovnána katalytická účinnost enzymu. ALDH22 je NAD+ depententní enzym s širokou substrátovou specifitou, který s vysokou katalytickou účinností přeměňuje acetaldehyd, citral, trans 2 nonenal a 3 metyl 2 butenal, navíc může být zapojen ve fenylpropanoidové nebo lipoxygenasové dráze, čemuž napovídá i jeho vysoká exprese v embryu a plodu.
Anotace v angličtině
This thesis deals with cloning, purification, and characterization aldehyde dehydrogenase family 22 (ALDH22) from barley and maize. It is a new protein family and little is known about it. It was conducted a phylogenetic analysis of ALDH22, the protein was described in algae and terrestrial plants suggesting it was evolved before the transition of aquatic plants onto land. Furthermore, ALDH22 was confirmed in most accessible organisms. In the experiment part, ALDH22 from selected tissue was cloned in Escherichia coli and ALDH22 was purified from their lysate by affinity and ion exchange chromatography. Optimal pH, substrate specificity and kinetics parameters (Km and Vlim) for selected substrates were determined. It was also compared catalytic efficiency for selected substrates. ALDH22 is a NAD+ dependent enzyme with broad substrate specificity, it metabolizes acetaldehyde, citral, trans 2 nonenal and 3 methyl 2 buthenal with high catalytic efficiency. In addition, ALDH22 probably participate in the phenylpropanoid pathway or lipoxygenase pathway as its high expression in embryo and fruit suggests.
Tato diplomová práce se zabývá klonováním, purifikací a charakterizací ječmenné a kukuřičné aldehyddehydrogenasy rodiny 22 (ALDH22), což je nově objevená rodina a nebyla zatím dostatečně prozkoumána. Byla provedena fylogenetická analýza ALDH22, tento protein byl popsán u řas i suchozemských rostlin, tudíž se vyvinul již před přechodem rostlin z vody na souš, navíc byl přítomen u většiny dostupných organismů. V experimentální části byl gen pro ALDH22 z vybraných pletiv vložen do expresních bakterií Escherichia coli, z jejichž lyzátu byl protein pomocí afinitivní a iontoměničové chromatografie purifikován. Bylo stanoveno pH optimum, substrátová specifita a kinetické parametry Km a Vlim vybraných substrátů, u nichž byla porovnána katalytická účinnost enzymu. ALDH22 je NAD+ depententní enzym s širokou substrátovou specifitou, který s vysokou katalytickou účinností přeměňuje acetaldehyd, citral, trans 2 nonenal a 3 metyl 2 butenal, navíc může být zapojen ve fenylpropanoidové nebo lipoxygenasové dráze, čemuž napovídá i jeho vysoká exprese v embryu a plodu.
Anotace v angličtině
This thesis deals with cloning, purification, and characterization aldehyde dehydrogenase family 22 (ALDH22) from barley and maize. It is a new protein family and little is known about it. It was conducted a phylogenetic analysis of ALDH22, the protein was described in algae and terrestrial plants suggesting it was evolved before the transition of aquatic plants onto land. Furthermore, ALDH22 was confirmed in most accessible organisms. In the experiment part, ALDH22 from selected tissue was cloned in Escherichia coli and ALDH22 was purified from their lysate by affinity and ion exchange chromatography. Optimal pH, substrate specificity and kinetics parameters (Km and Vlim) for selected substrates were determined. It was also compared catalytic efficiency for selected substrates. ALDH22 is a NAD+ dependent enzyme with broad substrate specificity, it metabolizes acetaldehyde, citral, trans 2 nonenal and 3 methyl 2 buthenal with high catalytic efficiency. In addition, ALDH22 probably participate in the phenylpropanoid pathway or lipoxygenase pathway as its high expression in embryo and fruit suggests.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
Vypracování rešerše
Fylogenetická analýza aldehyddehydrogenasy rodiny 22
Určení expresního profilu genu kódující aldehyddehydrogenasu rodiny 22 pomocí kvantitativní PCR
Klonování aldehyddehydrogenasy rodiny 22 a exprese v Escherichia coli
Optimalizace exprese a purifikace
Charakterizace rekombinantních proteinů
Zásady pro vypracování
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
Vypracování rešerše
Fylogenetická analýza aldehyddehydrogenasy rodiny 22
Určení expresního profilu genu kódující aldehyddehydrogenasu rodiny 22 pomocí kvantitativní PCR
Klonování aldehyddehydrogenasy rodiny 22 a exprese v Escherichia coli
Optimalizace exprese a purifikace
Charakterizace rekombinantních proteinů
Seznam doporučené literatury
An X., Duan F.Y., Guo S., Chen F.J., Yuan L.X., Gu R.L. (2014): Transcriptional regulation of expression of the maize aldehyde dehydrogenase 7 gene (ZmALDH7B6) in response to abiotic stresses.
Brocker C., Lassen N., Estey Tia (2010): Aldehyde Dehydrogenase 7A1 (ALDH7A1) Is a Novel Enzyme Involved in Cellular Defense against Hyperosmotic Stress .
Chen J.M., Wei B., Li G.L., Fan R.C., Zhong Y.D., Wang, X.P., Zhang X.Q. (2015): TraeALDH7B1-5A, encoding aldehyde dehydrogenase 7 in wheat, confers improved drought tolerance in Arabidopsis. 4. Huang W., Ma X., Wang Q., Gao Y., Xue Y., Niu X., Yu G., Liu Y. (2008): Signicant improvement of stress tolerance in tobacco plants by overexpressing a stress-responsive aldehyde dehydrogenase gene from maize (Zea mays).
Kirch H.H., Schlingensiepen S., Kotchoni S., Sunkar R., Bartels D. (2005): Detailed expression analysis of selected genes of the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily in Arabidopsis thaliana.
Končitíkova R., Vigouroux A. , Kopečná M., Andree T., Bartoš J., Šebela M., Morera, S., Kopečný D. (2015): Role and structural characterization of plant aldehyde dehydrogenases from family 2 and family 7.
Mills P.B., Struys E., Jakobs C., Plecko B., Baxter P., Baumgartner M., Willemsen M.A., Omran H., Tacke U., Uhlenberg B., Weschke B., Clayton P.T. (2006): Mutations in antiquitin in individuals with pyridoxine-dependent seizures. 8. Sophos N.A., Vasiliou V. (2003): Aldehyde dehydrogenase gene superfamily: the 2002 update.
Seznam doporučené literatury
An X., Duan F.Y., Guo S., Chen F.J., Yuan L.X., Gu R.L. (2014): Transcriptional regulation of expression of the maize aldehyde dehydrogenase 7 gene (ZmALDH7B6) in response to abiotic stresses.
Brocker C., Lassen N., Estey Tia (2010): Aldehyde Dehydrogenase 7A1 (ALDH7A1) Is a Novel Enzyme Involved in Cellular Defense against Hyperosmotic Stress .
Chen J.M., Wei B., Li G.L., Fan R.C., Zhong Y.D., Wang, X.P., Zhang X.Q. (2015): TraeALDH7B1-5A, encoding aldehyde dehydrogenase 7 in wheat, confers improved drought tolerance in Arabidopsis. 4. Huang W., Ma X., Wang Q., Gao Y., Xue Y., Niu X., Yu G., Liu Y. (2008): Signicant improvement of stress tolerance in tobacco plants by overexpressing a stress-responsive aldehyde dehydrogenase gene from maize (Zea mays).
Kirch H.H., Schlingensiepen S., Kotchoni S., Sunkar R., Bartels D. (2005): Detailed expression analysis of selected genes of the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily in Arabidopsis thaliana.
Končitíkova R., Vigouroux A. , Kopečná M., Andree T., Bartoš J., Šebela M., Morera, S., Kopečný D. (2015): Role and structural characterization of plant aldehyde dehydrogenases from family 2 and family 7.
Mills P.B., Struys E., Jakobs C., Plecko B., Baxter P., Baumgartner M., Willemsen M.A., Omran H., Tacke U., Uhlenberg B., Weschke B., Clayton P.T. (2006): Mutations in antiquitin in individuals with pyridoxine-dependent seizures. 8. Sophos N.A., Vasiliou V. (2003): Aldehyde dehydrogenase gene superfamily: the 2002 update.
Přílohy volně vložené
CD-ROM
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Produkce a charakterizace aldehyddehydrogenas rodiny 22 z ječmene a kukuřice studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku vedoucího i oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
prof. Marek Šebela: Jaké kritérium bylo použito pro filtrování homologie proteinových sekvencí?
prof. Ivo Frébort: Signální sekvence - jaký vliv si myslíte, že má na expresi?
doc. Marek Petřivalský: Vůně plodů a reprodukčních orgánů.
dr. Mária Škrabišová: Ve shodě AA sekvence s kukuřičnou ALDH22 bych byla opatrná, protože u nejpodobnější neanotovaná sekvence (NP).