Thesis info Molekulární detekce vybraných bodových mutací odpovědných za rezistenci k pyrethroidům v genu pro sodíkový kanál kleštíka včelího (Varroa destructor)
Cílem diplomové práce je navrhnout a optimalizovat diagnostickou metodu, kterou by bylo možné detekovat přítomnost bodových mutací nukleotidů 1710 a 1712 ve VmNa genu pro napěťově řízený sodíkový kanál kleštíka včelího (Varroa destructor), které vedou k aminokyselinovým substitucím na pozici 925 a způsobují tak rezistenci tohoto parazita k přípravkům obsahujícím tau-fluvalinát. Teoretická část práce je zaměřena na biologii kleštíka včelího, mechanismy vzniku rezistence roztočů, varroacidní látky a na metody sloužící k molekulární detekci rezistence roztočů. V rámci experimentální části práce byla vytvořena a zoptimalizována Tříprimerová alelicky specifická PCR (3-PAS-PCR) diagnostická metoda umožňující snadnou a spolehlivou detekci wild-type a všech mutantních genotypů, které byly doposud identifikovány ve vztahu k rezistenci kleštíka k tau-fluvalinátu.
Annotation in English
The purpose of this master thesis is to design and optimize a diagnostic method which could be used for detection of point mutations of nucleotides 1710 and 1712 in Varroa destructor voltage-gated sodium channel gene (VmNa) which lead to amino acid substitutions at position 925 and so they are responsible for Varroa tau-fluvalinate resistance. The theoretical part is devoted to a biology of Varroa mite, to resistance mechanisms, varroacid substances and to diagnostic methods for mite resistance detection. In the experimental part Three primered allele specific PCR (3-PAS-PCR) diagnostic method was created and optimalized, this method enables a basic and reliable detection of wild-type and all mutant genotypes which were identified in relation to Varroa tau-fluvalinate resistance.
point mutations, mite Varroa destructor, Honey Bee (Apis mellifera), polymerase chain reaction, resistance, tau-fluvalinate, Three primered allele specific PCR (3-PAS-PCR)
Length of the covering note
84 s. (140 020 znaků)
Language
CZ
Annotation
Cílem diplomové práce je navrhnout a optimalizovat diagnostickou metodu, kterou by bylo možné detekovat přítomnost bodových mutací nukleotidů 1710 a 1712 ve VmNa genu pro napěťově řízený sodíkový kanál kleštíka včelího (Varroa destructor), které vedou k aminokyselinovým substitucím na pozici 925 a způsobují tak rezistenci tohoto parazita k přípravkům obsahujícím tau-fluvalinát. Teoretická část práce je zaměřena na biologii kleštíka včelího, mechanismy vzniku rezistence roztočů, varroacidní látky a na metody sloužící k molekulární detekci rezistence roztočů. V rámci experimentální části práce byla vytvořena a zoptimalizována Tříprimerová alelicky specifická PCR (3-PAS-PCR) diagnostická metoda umožňující snadnou a spolehlivou detekci wild-type a všech mutantních genotypů, které byly doposud identifikovány ve vztahu k rezistenci kleštíka k tau-fluvalinátu.
Annotation in English
The purpose of this master thesis is to design and optimize a diagnostic method which could be used for detection of point mutations of nucleotides 1710 and 1712 in Varroa destructor voltage-gated sodium channel gene (VmNa) which lead to amino acid substitutions at position 925 and so they are responsible for Varroa tau-fluvalinate resistance. The theoretical part is devoted to a biology of Varroa mite, to resistance mechanisms, varroacid substances and to diagnostic methods for mite resistance detection. In the experimental part Three primered allele specific PCR (3-PAS-PCR) diagnostic method was created and optimalized, this method enables a basic and reliable detection of wild-type and all mutant genotypes which were identified in relation to Varroa tau-fluvalinate resistance.
point mutations, mite Varroa destructor, Honey Bee (Apis mellifera), polymerase chain reaction, resistance, tau-fluvalinate, Three primered allele specific PCR (3-PAS-PCR)
Research Plan
1. Vypracování rešerše na téma diplomové práce.
2. Shromáždění dostupných literárních zdrojů.
3. Navrhnout způsob detekce bodových mutací v genu pro sodíkový kanál kleštíka včelího, které souvisejí s rezistencí tohoto včelího ektoparazita vůči tau-fluvalinátu. Detekci založit na využití PCR se třemi primery či zkombinováním PCR a následného restrikčního štěpení produktu.
Rozsah práce 60 stran
Research Plan
1. Vypracování rešerše na téma diplomové práce.
2. Shromáždění dostupných literárních zdrojů.
3. Navrhnout způsob detekce bodových mutací v genu pro sodíkový kanál kleštíka včelího, které souvisejí s rezistencí tohoto včelího ektoparazita vůči tau-fluvalinátu. Detekci založit na využití PCR se třemi primery či zkombinováním PCR a následného restrikčního štěpení produktu.
Rozsah práce 60 stran
Recommended resources
1) Hubert, J., Nesvorná, M., Kamler, M., Kopecký, J., Tyl, J., Titěra, D., Stará, J. (2014): Point mutations in the sodium channel gene conferring tau-fluvalinate resistance in Varroa destructor. Pest Management Science, 70, 889-894.
2) Wang, R., Liu, Z., Dong, K., Jelzen, P., Pettis, J., Huang, Z. (2002): Association of novel mutations in a sodium channel gene with fluvalinate resistance in the mite, Varroa destructor. Journal of Apicultural Research, 41, 17-25.
3) Dong, K., Du, Y., Rinkevich, F., Nomura, Y., Xu, P., Wang, L. et al. (2014): Molecular biology of insect sodium channels and pyrethroid resistance. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 50C, 117.
4) González-Cabrera, J., Rodríguez-Vargas, S., Davies, T.G.E., Filed, L.M., Schmehl, D., Ellis, J.D., Krieger, K., Williamson, M.S. (2016): Novel Mutations in the Voltage-Gated Sodium Channel of Pyrethroid-Resistant Varroa destructor Populations from the Southeastern USA. PLoS ONE11: e0155332.
5) Danihlík, J., Dlouhá, Š., Dostálková, S., Kabát, M., Hroncová, Z., Petřivalský, M., Prýmas, L. (2017): Včelařství, Svazek II. (Biologie včely medonosné, Šlechtění včel a chov matek. Pracovní společnost nástavkových včelařů CZ, z.s.
Recommended resources
1) Hubert, J., Nesvorná, M., Kamler, M., Kopecký, J., Tyl, J., Titěra, D., Stará, J. (2014): Point mutations in the sodium channel gene conferring tau-fluvalinate resistance in Varroa destructor. Pest Management Science, 70, 889-894.
2) Wang, R., Liu, Z., Dong, K., Jelzen, P., Pettis, J., Huang, Z. (2002): Association of novel mutations in a sodium channel gene with fluvalinate resistance in the mite, Varroa destructor. Journal of Apicultural Research, 41, 17-25.
3) Dong, K., Du, Y., Rinkevich, F., Nomura, Y., Xu, P., Wang, L. et al. (2014): Molecular biology of insect sodium channels and pyrethroid resistance. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 50C, 117.
4) González-Cabrera, J., Rodríguez-Vargas, S., Davies, T.G.E., Filed, L.M., Schmehl, D., Ellis, J.D., Krieger, K., Williamson, M.S. (2016): Novel Mutations in the Voltage-Gated Sodium Channel of Pyrethroid-Resistant Varroa destructor Populations from the Southeastern USA. PLoS ONE11: e0155332.
5) Danihlík, J., Dlouhá, Š., Dostálková, S., Kabát, M., Hroncová, Z., Petřivalský, M., Prýmas, L. (2017): Včelařství, Svazek II. (Biologie včely medonosné, Šlechtění včel a chov matek. Pracovní společnost nástavkových včelařů CZ, z.s.
Enclosed appendices
1 CD
Appendices bound in thesis
illustrations, schemes, tables
Taken from the library
Yes
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Kateřiny Lahnerové zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce RNDr. Petra Nádvorníka, Ph.D.
a oponenta doc. RNDr. Vladana Ondřeje, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- Kleštík včelí - charakteristika a význam, ochrana vůči němu
- Bodové mutace genu VmNa zprostředkující rezistenci vůči Tau-fluvalinátu
- Metodický přístup - příprimerová alelelicky specifická PCR (3-PAS-PCR)
- Hodnocení rezistence populace kleštíka včelího na souboru vzorků původem z ČR a mimo ČR
- Navržení 3-PAS-PCR detekční metody skríningu rezistence kleštíků k Tau-fluvalinátu
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Zdůrazněna vysoká kvalita vypracované práce
- Další účinné látky v boji s kleštíkem včelím: organické kyseliny (k. mravenčí, mléčná a šťavelová a přípravky jichž jsou součástí), zootechnická opatření
- Způsoby odebírání měli - odběry průběžně, některé cíleně i po ošetření varoacidem nebo akaricidem
- Ověření cílových mutací sekvenováním
- Praktické využití, zájem včelařů o testování
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala pohotově, s hlubokou znalostí problematiky a možné aplikace výsledků.