Tato bakalářská práce se zabývá klonováním a expresí genu lidské aldehyddehydrogenasy 9 (HsALDH9). V teoretické části je popsán metabolismus aldehydů v rostlinné a živočišné říši se zaměřením zejména na studovanou HsALDH9. V experimentální části byl naklonován gen HsALDH9 do dvou vektorů pETDuet a pCDFDuet. Následnou heterologní expresí genu v buňkách Escherichia coli byl získán rekombinantní enzym nesoucí N-terminální histidinovou kotvu a umožňující purifikaci pomocí afinitní chromatografie. Metodou SDS-PAGE byla určena molekulová hmotnost monomeru 54 kDa a ověřena čistota proteinu. Nakonec byla testována substrátová specificita enzymu s použitím osmi aldehydických substrátů, z nichž nejlepší byl N, N, N-trimethyl-4-aminobutyraldehyd.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis deals with a cloning and expression of human aldehyde dehydrogenase 9 (HsALDH9) gene. The theoretical part describes the methabolism of aldehydes in plant and animal kingdoms, focusing in particular on the studied HsALDH9. In the experimental part, the HsALDH9 gene was cloned into the two vectors, namely pETDuet and pCDFDuet. Subsequent heterologous expression in Escherichia coli cells yielded the recombinant enzyme carrying N-terminal His-tag allowing for a purification by affinity chromatografy. The molecular weight of monomer is 54 kDa as well as the purity was determined by SDS-PAGE. Finally, substrate specificity of the enzyme was tested using eight aldehyde substrates. The best one was N, N, N-trimethyl-4-aminobutyraldehyde.
aldehyde, aldehyde dehydrogenase, aminoaldehyde dehydrogenase, human aldehyde dehydrogenase 9
Rozsah průvodní práce
53 s. (10 133 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Tato bakalářská práce se zabývá klonováním a expresí genu lidské aldehyddehydrogenasy 9 (HsALDH9). V teoretické části je popsán metabolismus aldehydů v rostlinné a živočišné říši se zaměřením zejména na studovanou HsALDH9. V experimentální části byl naklonován gen HsALDH9 do dvou vektorů pETDuet a pCDFDuet. Následnou heterologní expresí genu v buňkách Escherichia coli byl získán rekombinantní enzym nesoucí N-terminální histidinovou kotvu a umožňující purifikaci pomocí afinitní chromatografie. Metodou SDS-PAGE byla určena molekulová hmotnost monomeru 54 kDa a ověřena čistota proteinu. Nakonec byla testována substrátová specificita enzymu s použitím osmi aldehydických substrátů, z nichž nejlepší byl N, N, N-trimethyl-4-aminobutyraldehyd.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis deals with a cloning and expression of human aldehyde dehydrogenase 9 (HsALDH9) gene. The theoretical part describes the methabolism of aldehydes in plant and animal kingdoms, focusing in particular on the studied HsALDH9. In the experimental part, the HsALDH9 gene was cloned into the two vectors, namely pETDuet and pCDFDuet. Subsequent heterologous expression in Escherichia coli cells yielded the recombinant enzyme carrying N-terminal His-tag allowing for a purification by affinity chromatografy. The molecular weight of monomer is 54 kDa as well as the purity was determined by SDS-PAGE. Finally, substrate specificity of the enzyme was tested using eight aldehyde substrates. The best one was N, N, N-trimethyl-4-aminobutyraldehyde.
aldehyde, aldehyde dehydrogenase, aminoaldehyde dehydrogenase, human aldehyde dehydrogenase 9
Zásady pro vypracování
V teoretické části bude provedena literární rešerše týkající se metabolismu aldehydů v rostlinné a živočišné říši.
V praktické části bude gen kódující lidský enzym aldehyd dehydrogenasy naklonován do dvou expresních vektorů, následně exprimován, purifikován pomocí afinitní chromatografie a budou testovány možné
substráty.
Cíle práce:
1. Klonování genu hALDH9 do dvou vektorů
2. Optimalizace exprese při různých podmínkách
3. Purifikace afinitní chromatografií
4. Testování možných substrátů
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
V teoretické části bude provedena literární rešerše týkající se metabolismu aldehydů v rostlinné a živočišné říši.
V praktické části bude gen kódující lidský enzym aldehyd dehydrogenasy naklonován do dvou expresních vektorů, následně exprimován, purifikován pomocí afinitní chromatografie a budou testovány možné
substráty.
Cíle práce:
1. Klonování genu hALDH9 do dvou vektorů
2. Optimalizace exprese při různých podmínkách
3. Purifikace afinitní chromatografií
4. Testování možných substrátů
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
- Vaz FM, Fouchier SW, Ofman R, Sommer M, Wanders RJ. Molecular and biochemical characte-rization of rat gamma-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase and evidence for the involvement of human aldehyde dehydrogenase 9 in carnitine biosynthesis. 2000, J Biol Chem. 10; 275(10):7390-4.
- Kopečny D, Končitíková R, Tylichová M, Vigouroux A, Moskalíková H, Soural M, Šebela M, Moréra S. Plant ALDH10 family: identifying critical residues for substrate specificity and trapping a thiohemiacetal intermediate. 2013, J Biol Chem. 29;288(13):9491-507.
- Matsunaga A, Harita Y, Shibagaki Y, Shimizu N, Shibuya K, Ono H, Kato H, Sekine T, Sakamoto N, Igarashi T, Hattori S., Identification of 4-Trimethylaminobutyraldehyde Dehydrogenase (TMABA-DH) as a Candidate Serum Autoantibody Target for Kawasaki Disease. 2015, PLoS One., May 26;10(5):e0128189.
Seznam doporučené literatury
- Vaz FM, Fouchier SW, Ofman R, Sommer M, Wanders RJ. Molecular and biochemical characte-rization of rat gamma-trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase and evidence for the involvement of human aldehyde dehydrogenase 9 in carnitine biosynthesis. 2000, J Biol Chem. 10; 275(10):7390-4.
- Kopečny D, Končitíková R, Tylichová M, Vigouroux A, Moskalíková H, Soural M, Šebela M, Moréra S. Plant ALDH10 family: identifying critical residues for substrate specificity and trapping a thiohemiacetal intermediate. 2013, J Biol Chem. 29;288(13):9491-507.
- Matsunaga A, Harita Y, Shibagaki Y, Shimizu N, Shibuya K, Ono H, Kato H, Sekine T, Sakamoto N, Igarashi T, Hattori S., Identification of 4-Trimethylaminobutyraldehyde Dehydrogenase (TMABA-DH) as a Candidate Serum Autoantibody Target for Kawasaki Disease. 2015, PLoS One., May 26;10(5):e0128189.
Přílohy volně vložené
1 CD
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Dr. Danihlík: Co je na sloupcovém grafu s výsledky relativní aktivity bráno za 100 %? Co znamenají chybové úsečky u daných měření?
Doc. Petřivalský: Jak je myšlen popis pH v grafu na obr. 18?
Dr. Plíhal: Proč jste vybrala zrovna tyto hodnoty pH?