Mech Physcomitrella patens je modelový organismus patřící z fylogenetického hlediska mezi vývojově staré organismy. V posledních letech vzrostl zájem o jeho využití pro základní výzkum, k čemuž přispěl zejména osekvenovaný genom a možnost využití moderních metod jako RNA interference nebo CRISPR/Cas9. Jeho růst a vývoj je kontrolován především evolučně starými fytohormony cytokininy, auxiny a kyselinou abscisovou. Genom tohoto mechu kóduje pouze homology pro tRNA-IPT, klíčový enzym cytokininové biosyntetické dráhy, která pravděpodobně není významným zdrojem aktivních volných cytokininů v kvetoucích rostlinách. Současné poznatky naznačují, že tato dráha je klíčovou pro biosyntézu aktivních cytokininů ve Physcomitrella patens, současně je však pravděpodobná existence i druhé, tRNA-nezávislé dráhy. Tato dráha se zdá důležitá v produkci aktivních cytokininů v Physcomitrella patens, a tak je žádoucí podrobný výzkum ostatních šesti IPT genů tohoto mechu. Tato práce je zaměřena na heterologní produkci IPT z tohoto mechu s využitím E. coli a ověření jejich funkčnosti k různým substrátům. V rámci práce byly také připraveny binární konstrukty pro expresi proteinů PpIPT1, 3, 4 a 6 in planta. Tyto konstrukty budou v budoucnu využity pro infiltraci do listů tabáku (Nicotiana bentamiana) a k transformaci rostlin Arabidopsis thaliana Col0 metodou floral-dip.
Anotace v angličtině
The moss Physcomitrella patens is a model organism that belongs phylogenetically to evolutionarily ancient organisms. The interest in the use of this moss for basic research grew in the last years, mostly due to the known genome sequence and the possibility of use of modern methods such as RNA interference or CRISPR/Cas9. Its growth and development are controlled predominately by evolutionarily old phytohormones cytokinins, auxins, and abscisic acid. The genome of this moss encodes only homologues for tRNA-IPT, a key enzyme of the cytokinin biosynthetic pathway, which is likely not an important source of active free cytokinins in higher plants. Recent knowledge suggests that this pathway is crucial for the biosynthesis of active cytokinins in Physcomitrella patens, however, there exists, probably also a second, tRNA-independent pathway. This putative pathway seems to be important for the production of active cytokinins in Physcomitrella patens, so the detailed research of the remaining IPT family members in this moss is of great importance. This work focuses on the heterologous production of Physcomitrella IPTs in E. coli and on the verification of their functionality with various substrates. Binary plasmid constructs for the in planta expression of PpIPT1, 3, 4, and 6 have been prepared. These constructs will be used for the infiltration of tobacco leaves (Nicotiana bentamiana) and the transformation of Arabidopsis thaliana Col0 plants using the floral-dip method in near future.
Mech Physcomitrella patens je modelový organismus patřící z fylogenetického hlediska mezi vývojově staré organismy. V posledních letech vzrostl zájem o jeho využití pro základní výzkum, k čemuž přispěl zejména osekvenovaný genom a možnost využití moderních metod jako RNA interference nebo CRISPR/Cas9. Jeho růst a vývoj je kontrolován především evolučně starými fytohormony cytokininy, auxiny a kyselinou abscisovou. Genom tohoto mechu kóduje pouze homology pro tRNA-IPT, klíčový enzym cytokininové biosyntetické dráhy, která pravděpodobně není významným zdrojem aktivních volných cytokininů v kvetoucích rostlinách. Současné poznatky naznačují, že tato dráha je klíčovou pro biosyntézu aktivních cytokininů ve Physcomitrella patens, současně je však pravděpodobná existence i druhé, tRNA-nezávislé dráhy. Tato dráha se zdá důležitá v produkci aktivních cytokininů v Physcomitrella patens, a tak je žádoucí podrobný výzkum ostatních šesti IPT genů tohoto mechu. Tato práce je zaměřena na heterologní produkci IPT z tohoto mechu s využitím E. coli a ověření jejich funkčnosti k různým substrátům. V rámci práce byly také připraveny binární konstrukty pro expresi proteinů PpIPT1, 3, 4 a 6 in planta. Tyto konstrukty budou v budoucnu využity pro infiltraci do listů tabáku (Nicotiana bentamiana) a k transformaci rostlin Arabidopsis thaliana Col0 metodou floral-dip.
Anotace v angličtině
The moss Physcomitrella patens is a model organism that belongs phylogenetically to evolutionarily ancient organisms. The interest in the use of this moss for basic research grew in the last years, mostly due to the known genome sequence and the possibility of use of modern methods such as RNA interference or CRISPR/Cas9. Its growth and development are controlled predominately by evolutionarily old phytohormones cytokinins, auxins, and abscisic acid. The genome of this moss encodes only homologues for tRNA-IPT, a key enzyme of the cytokinin biosynthetic pathway, which is likely not an important source of active free cytokinins in higher plants. Recent knowledge suggests that this pathway is crucial for the biosynthesis of active cytokinins in Physcomitrella patens, however, there exists, probably also a second, tRNA-independent pathway. This putative pathway seems to be important for the production of active cytokinins in Physcomitrella patens, so the detailed research of the remaining IPT family members in this moss is of great importance. This work focuses on the heterologous production of Physcomitrella IPTs in E. coli and on the verification of their functionality with various substrates. Binary plasmid constructs for the in planta expression of PpIPT1, 3, 4, and 6 have been prepared. These constructs will be used for the infiltration of tobacco leaves (Nicotiana bentamiana) and the transformation of Arabidopsis thaliana Col0 plants using the floral-dip method in near future.
1. Literární rešerše na téma biosyntéza cytokininů v nižších rostlinách, se zaměřením na Physcomitrella patens.
2. Příprava rekombinantních PpIPT proteinů v E. coli a jejich purifikace.
3. Biochemická charakterizace připravených proteinů. Ověření jejich funkčnosti a specifity k různým substrátům.
4. Příprava konstruktů pro expresi PpIPT v Arabidopsis thaliana.
5. Zpracování výsledků a sepsání experimentální části DP.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
1. Literární rešerše na téma biosyntéza cytokininů v nižších rostlinách, se zaměřením na Physcomitrella patens.
2. Příprava rekombinantních PpIPT proteinů v E. coli a jejich purifikace.
3. Biochemická charakterizace připravených proteinů. Ověření jejich funkčnosti a specifity k různým substrátům.
4. Příprava konstruktů pro expresi PpIPT v Arabidopsis thaliana.
5. Zpracování výsledků a sepsání experimentální části DP.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
- Soderberg T. and Poulter C.D. (2000): Escherichia coli Dimethylallyl Diphosphate:tRNA Dimethylallyltransferase: Essential Elements for Recognition of tRNA Substrates Within the Anticodon Stem -Loop. Biochemistry 39, 6546-6553.
- Von Schwartzenberg K., Núnez M.F., Blaschke H., Dobrev P.I., Novák O., Motyka V. and Strnad M.(2007): Cytokinins in the Bryophyte Physcomitrella patens: Analyses of Activity, Distribution, and Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase Overexpression Reveal the Role of Extracellular Cytokinins. Plant Physiology 145, 786-800.
- Yevdakova N.A. and von Schwartzenberg K. (2007): Characterisation of a prokaryote-type tRNAisopentenyltransferase gene from the moss Physcomitrella patens. Planta 226, 683-695.
- Pratt-Hyatt M. et al. (2013):Mod5 protein binds to tRNA gene complexes and affects local transcriptional silencing. PNAS 111, 2397-2398.
- Patil G. and Nicander B. (2013): Identification of two additional members of the tRNA isopentenyltransferase family in Physcomitrella patens. Plant Mol Biol 82, 417-426.
- Lamichhane T.N., Blewett N.H., Crawford A.K., Cherkasova V.A., Iben J.R, Begley T.J., Farabaugh P.J. and Maraia R.J. (2013): Lack of tRNA Modification Isopentenyl-A37 Alters mRNA Decoding and Causes Metabolic Deficiencies in Fission Yeast. Molecular and Celluar Biology 33, 2918-2929.
- Lindner A., Lang D., Seifert M., Podlešáková K., Novák O., Strnad M., Reski R. and von Schwartzenberg K. (2014): Isopentenyltransferase-1 (IPT1) knockout in Physcomitrella together with phylogenetic analyses of IPTs provide insights into evolution of plant cytokinin biosynthesis. Journal of Experimental Botany 65, 2533-2543.
Seznam doporučené literatury
- Soderberg T. and Poulter C.D. (2000): Escherichia coli Dimethylallyl Diphosphate:tRNA Dimethylallyltransferase: Essential Elements for Recognition of tRNA Substrates Within the Anticodon Stem -Loop. Biochemistry 39, 6546-6553.
- Von Schwartzenberg K., Núnez M.F., Blaschke H., Dobrev P.I., Novák O., Motyka V. and Strnad M.(2007): Cytokinins in the Bryophyte Physcomitrella patens: Analyses of Activity, Distribution, and Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase Overexpression Reveal the Role of Extracellular Cytokinins. Plant Physiology 145, 786-800.
- Yevdakova N.A. and von Schwartzenberg K. (2007): Characterisation of a prokaryote-type tRNAisopentenyltransferase gene from the moss Physcomitrella patens. Planta 226, 683-695.
- Pratt-Hyatt M. et al. (2013):Mod5 protein binds to tRNA gene complexes and affects local transcriptional silencing. PNAS 111, 2397-2398.
- Patil G. and Nicander B. (2013): Identification of two additional members of the tRNA isopentenyltransferase family in Physcomitrella patens. Plant Mol Biol 82, 417-426.
- Lamichhane T.N., Blewett N.H., Crawford A.K., Cherkasova V.A., Iben J.R, Begley T.J., Farabaugh P.J. and Maraia R.J. (2013): Lack of tRNA Modification Isopentenyl-A37 Alters mRNA Decoding and Causes Metabolic Deficiencies in Fission Yeast. Molecular and Celluar Biology 33, 2918-2929.
- Lindner A., Lang D., Seifert M., Podlešáková K., Novák O., Strnad M., Reski R. and von Schwartzenberg K. (2014): Isopentenyltransferase-1 (IPT1) knockout in Physcomitrella together with phylogenetic analyses of IPTs provide insights into evolution of plant cytokinin biosynthesis. Journal of Experimental Botany 65, 2533-2543.
Přílohy volně vložené
1 CD ROM
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce student zodpověděl uspokojivě, doložil je vypracované v písemné formě a prezentoval také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
doc. Galuszka: Jak budete v rostlině detekovat aktivní enzym?