Tato bakalářská práce je zaměřena na přípravu konstruktu exprimujícího fúzní protein YFP-OMTK1 pod kontrolou konstitutivního promotoru. Gen OMTK1 byl objeven v tolici vojtěšce (Medicago sativa), která je využívána jako krmivo pro hospodářská zvířata. Tento gen patří mezi MAPKKK a je spojen s reakcí na stres vyvolanou peroxidem vodíku. Literární rešerše je zaměřena na obecnou charakterizaci mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), na komplexní signalizační kaskády v rostlinách v reakci na patogeny, abiotický stres, růst a vývin rostlin, v nichž jsou MAPK zapojeny. Následně je práce zaměřena na vybrané MAPK z M. sativa a princip Gateway klonování, který byl využit při klonování konstruktu pro expresi fúzního proteinu.
V rámci experimentální části bakalářské práce byla nejdříve získána sekvence genu OMTK1, dle které byly navrhnuty specifické primery. Technikou MultiSite Gateway klonování byl následně připraven konstrukt AtUBQ10::YFP:cOMTK1. Metodou transientní transformace listů rostliny N. benthamiana bylo zjištěno, že protein OMTK1 je lokalizován v cytoplazmatické membráně. Následně byla metodou nativní PAGE a Western blot ověřena exprese fúzního proteinu.
Taktéž bylo potvrzeno možné zapojení genu OMTK1 v programované buněčné smrti pozorováním fenotypu listů rostliny N. benthamiana, ve výše zmíněném experimentu.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis focuses on the preparation of a construct expressing the YFP-OMTK1 fusion protein under the control of a constitutive promoter. The OMTK1 gene was discovered in alfalfa (Medicago sativa), which is used as a livestock feed. The OMTK1 gene belongs to the MAPKKK family and is associated with the response to hydrogen peroxide-induced stress. The literary research is focused on the general characterization of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), on the complex signaling cascades in plants in response to pathogens, abiotic stress, and plant growth and development in which MAPKs are involved. The theoretical overview is also focused on MAPKs from M. sativa and the principle of Gateway cloning that was used to clone a construct for fusion protein expression.
In the experimental part of the bachelor thesis, the sequence of the OMTK1 gene was first obtained, according to which the specific primers were designed. Then, the construct AtUBQ10::YFP:cOMTK1 was prepared by the MultiSite Gateway cloning technique. The OMTK1 protein was found to be localized in the cytoplasmic membrane by transient transformation of the N. benthamiana leaves. Subsequently, the expression of the fusion protein was verified by native PAGE and Western blot.
The possible involvement of the OMTK1 gene in programmed cell death was confirmed by observing the phenotype of N. benthamiana in the aforementioned experiment.
Tato bakalářská práce je zaměřena na přípravu konstruktu exprimujícího fúzní protein YFP-OMTK1 pod kontrolou konstitutivního promotoru. Gen OMTK1 byl objeven v tolici vojtěšce (Medicago sativa), která je využívána jako krmivo pro hospodářská zvířata. Tento gen patří mezi MAPKKK a je spojen s reakcí na stres vyvolanou peroxidem vodíku. Literární rešerše je zaměřena na obecnou charakterizaci mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), na komplexní signalizační kaskády v rostlinách v reakci na patogeny, abiotický stres, růst a vývin rostlin, v nichž jsou MAPK zapojeny. Následně je práce zaměřena na vybrané MAPK z M. sativa a princip Gateway klonování, který byl využit při klonování konstruktu pro expresi fúzního proteinu.
V rámci experimentální části bakalářské práce byla nejdříve získána sekvence genu OMTK1, dle které byly navrhnuty specifické primery. Technikou MultiSite Gateway klonování byl následně připraven konstrukt AtUBQ10::YFP:cOMTK1. Metodou transientní transformace listů rostliny N. benthamiana bylo zjištěno, že protein OMTK1 je lokalizován v cytoplazmatické membráně. Následně byla metodou nativní PAGE a Western blot ověřena exprese fúzního proteinu.
Taktéž bylo potvrzeno možné zapojení genu OMTK1 v programované buněčné smrti pozorováním fenotypu listů rostliny N. benthamiana, ve výše zmíněném experimentu.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis focuses on the preparation of a construct expressing the YFP-OMTK1 fusion protein under the control of a constitutive promoter. The OMTK1 gene was discovered in alfalfa (Medicago sativa), which is used as a livestock feed. The OMTK1 gene belongs to the MAPKKK family and is associated with the response to hydrogen peroxide-induced stress. The literary research is focused on the general characterization of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), on the complex signaling cascades in plants in response to pathogens, abiotic stress, and plant growth and development in which MAPKs are involved. The theoretical overview is also focused on MAPKs from M. sativa and the principle of Gateway cloning that was used to clone a construct for fusion protein expression.
In the experimental part of the bachelor thesis, the sequence of the OMTK1 gene was first obtained, according to which the specific primers were designed. Then, the construct AtUBQ10::YFP:cOMTK1 was prepared by the MultiSite Gateway cloning technique. The OMTK1 protein was found to be localized in the cytoplasmic membrane by transient transformation of the N. benthamiana leaves. Subsequently, the expression of the fusion protein was verified by native PAGE and Western blot.
The possible involvement of the OMTK1 gene in programmed cell death was confirmed by observing the phenotype of N. benthamiana in the aforementioned experiment.
Cílem bakalářské práce je zvládnutí práce s odbornou (anglickou) literaturou a její následné zpracování do rešerše na danou problematiku. Dalším cílem je také klonování fúzního genu OMTK1. Dále se bakalářská práce bude zabývat experimenty zaměřenými na transientní transformaci, mikroskopické ověření signálu, nativní PAGE a Western blot.
V rámci teoretické části bude vypracována rešerše zaměřená na problematiku:
Přehled publikací o mitogen aktivovaných protein kinázách (MAPK) v M. sativa (hlavně OMTK1 a dalších MAPKs) a jejich ortolozích v M. truncatula, Arabidopsis thaliana a také jiných rostlinných druzích, podle dostupné literatury.
Přehled signálních drah MAPK se zaměřením na OMTK1 a další MAPKs (a jejich ortolozích) při vývinu a odpovědi na stres a také v souvislosti s regulací cytoskeletu a interakce rostliny s mikroorganismy.
Praktická část bakalářské práce bude zaměřena na:
Klonování konstruktu pro fúzní protein YFP-OMTK1 metodou MultiSite Gateway.
Metody detekce exprese fúzních proteinů- mikroskopické ověření signálu YFP-OMTK1, a také PAGE a Western blot (detekce fúzních proteinů).
Zásady pro vypracování
Cílem bakalářské práce je zvládnutí práce s odbornou (anglickou) literaturou a její následné zpracování do rešerše na danou problematiku. Dalším cílem je také klonování fúzního genu OMTK1. Dále se bakalářská práce bude zabývat experimenty zaměřenými na transientní transformaci, mikroskopické ověření signálu, nativní PAGE a Western blot.
V rámci teoretické části bude vypracována rešerše zaměřená na problematiku:
Přehled publikací o mitogen aktivovaných protein kinázách (MAPK) v M. sativa (hlavně OMTK1 a dalších MAPKs) a jejich ortolozích v M. truncatula, Arabidopsis thaliana a také jiných rostlinných druzích, podle dostupné literatury.
Přehled signálních drah MAPK se zaměřením na OMTK1 a další MAPKs (a jejich ortolozích) při vývinu a odpovědi na stres a také v souvislosti s regulací cytoskeletu a interakce rostliny s mikroorganismy.
Praktická část bakalářské práce bude zaměřena na:
Klonování konstruktu pro fúzní protein YFP-OMTK1 metodou MultiSite Gateway.
Metody detekce exprese fúzních proteinů- mikroskopické ověření signálu YFP-OMTK1, a také PAGE a Western blot (detekce fúzních proteinů).
Seznam doporučené literatury
Cardinale F, Meskiene I, Ouaked F, Hirt H (2002) Convergence and divergence of stress-induced mitogen-activated protein kinase signaling pathways at the level of two distinct mitogen-activated protein kinase kinases. The Plant Cell 14, 703-711.
Hrbáčková M, Luptovčiak I, Hlaváčková K, Dvořák P, Tichá M, Šamajová O, Novák D, Bednarz H, Niehaus K, Ovečka M, and Šamaj J (2021) Overexpression of alfalfa SIMK promotes root hair growth, nodule clustering and shoot biomass production. Plant Biotechnology Journal 19, 767-784.
Ichimura K, Shinozaki K, Tena G, Sheen J, Henry Y, Champion A, et al. (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. Trends Plant Science 7, 301-308.
Jonak C, Okresz L, Bögre L, Hirt H (2002) Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling. Current Opinion in Plant Biology 5, 415-424.
Kiegerl S, Cardinale F, Siligan C, Gross A, Baudouin E, Liwosz A, Eklöf S, Till S, Bögre L, Hirt H, Meskiene I. (2000) SIMKK, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase, is a specific activator of the salt stress-induced MAPK, SIMK. The Plant Cell 12, 2247-2258.
Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annual Review of Plant Biology 69, 237-265.
Křenek P, Šamajová O, Luptovčiak I, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2015) Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications, Biotechnology Advances 33, 1024-1042.
Malíšková A. (2021) Charakterizace SIMKK a PRKK proteinů u vojtešky Medicago sativa. Bakalářská práce, Oddělení buněčné biologie, CRH, PřF, Univerzita Palackého v Olomouci.
Nakagami H, Kiegerl S, Hirt H. (2004) OMTK1, a novel MAPKKK, channels oxidative stress signaling through direct MAPK interaction. Journal of Biological Chemistry 279, 26959-26966.
Ovečka M, Takáč T, Komis G, Vadovič P, Bekešová S, Doskočilová A, Smékalová V, Luptovčiak I, Šamajová O, Schweighofer A, Meskiene I, Jonak C, Křenek P, Lichtscheidl I, Skultety L, Hirt H, Šamaj J (2014) Salt-induced subcellular kinase relocation and seedling susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 65, 2335-2350.
Pavlíková M. (2022) Úlohy vybraných MAPK proteinů u vojtěšky Medicago sativa. Bakalářská práce, Katedra biotechnologií, PřF, Univerzita Palackého v Olomouci.
Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances 32, 2-11.
Smékalová V, Luptovčiak I, Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Doskočilová A, Takáč T, Vadovič P, Novák O, Pechan T, Ziemann A, Košútová P, Šamaj J (2014) Involvement of YODA and mitogen activated protein kinase 6 in Arabidopsis post-embryogenic root development through auxin up-regulation and cell division plane orientation. New Phytologist 203, 1175-1193
Suarez-Rodriguez MC, Petersen M, Mundy J (2010) Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling in Plants. Annual Review of Plant Biology 61, 621-49.
Šamaj J, Ovečka M, Hlavacka A, Lecourieux F, Meskiene I, Lichtscheidl I, Lenart P, Salaj J, Volkmann D, Bögre L, Baluška F, Hirt H (2002) Involvement of the mitogen-activated protein kinase SIMK in regulation of root hair tip-growth. EMBO Journal 21, 3296-3306.
Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science 18, 140-148.
Tena G, Asai T, Chiu WL, Sheen J (2001) Plant mitogen-activated protein kinase signaling cascades. Curren Opinion in Plant Biology 4, 392-400.
Seznam doporučené literatury
Cardinale F, Meskiene I, Ouaked F, Hirt H (2002) Convergence and divergence of stress-induced mitogen-activated protein kinase signaling pathways at the level of two distinct mitogen-activated protein kinase kinases. The Plant Cell 14, 703-711.
Hrbáčková M, Luptovčiak I, Hlaváčková K, Dvořák P, Tichá M, Šamajová O, Novák D, Bednarz H, Niehaus K, Ovečka M, and Šamaj J (2021) Overexpression of alfalfa SIMK promotes root hair growth, nodule clustering and shoot biomass production. Plant Biotechnology Journal 19, 767-784.
Ichimura K, Shinozaki K, Tena G, Sheen J, Henry Y, Champion A, et al. (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. Trends Plant Science 7, 301-308.
Jonak C, Okresz L, Bögre L, Hirt H (2002) Complexity, cross talk and integration of plant MAP kinase signalling. Current Opinion in Plant Biology 5, 415-424.
Kiegerl S, Cardinale F, Siligan C, Gross A, Baudouin E, Liwosz A, Eklöf S, Till S, Bögre L, Hirt H, Meskiene I. (2000) SIMKK, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase, is a specific activator of the salt stress-induced MAPK, SIMK. The Plant Cell 12, 2247-2258.
Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annual Review of Plant Biology 69, 237-265.
Křenek P, Šamajová O, Luptovčiak I, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2015) Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications, Biotechnology Advances 33, 1024-1042.
Malíšková A. (2021) Charakterizace SIMKK a PRKK proteinů u vojtešky Medicago sativa. Bakalářská práce, Oddělení buněčné biologie, CRH, PřF, Univerzita Palackého v Olomouci.
Nakagami H, Kiegerl S, Hirt H. (2004) OMTK1, a novel MAPKKK, channels oxidative stress signaling through direct MAPK interaction. Journal of Biological Chemistry 279, 26959-26966.
Ovečka M, Takáč T, Komis G, Vadovič P, Bekešová S, Doskočilová A, Smékalová V, Luptovčiak I, Šamajová O, Schweighofer A, Meskiene I, Jonak C, Křenek P, Lichtscheidl I, Skultety L, Hirt H, Šamaj J (2014) Salt-induced subcellular kinase relocation and seedling susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 65, 2335-2350.
Pavlíková M. (2022) Úlohy vybraných MAPK proteinů u vojtěšky Medicago sativa. Bakalářská práce, Katedra biotechnologií, PřF, Univerzita Palackého v Olomouci.
Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances 32, 2-11.
Smékalová V, Luptovčiak I, Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Doskočilová A, Takáč T, Vadovič P, Novák O, Pechan T, Ziemann A, Košútová P, Šamaj J (2014) Involvement of YODA and mitogen activated protein kinase 6 in Arabidopsis post-embryogenic root development through auxin up-regulation and cell division plane orientation. New Phytologist 203, 1175-1193
Suarez-Rodriguez MC, Petersen M, Mundy J (2010) Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling in Plants. Annual Review of Plant Biology 61, 621-49.
Šamaj J, Ovečka M, Hlavacka A, Lecourieux F, Meskiene I, Lichtscheidl I, Lenart P, Salaj J, Volkmann D, Bögre L, Baluška F, Hirt H (2002) Involvement of the mitogen-activated protein kinase SIMK in regulation of root hair tip-growth. EMBO Journal 21, 3296-3306.
Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science 18, 140-148.
Tena G, Asai T, Chiu WL, Sheen J (2001) Plant mitogen-activated protein kinase signaling cascades. Curren Opinion in Plant Biology 4, 392-400.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu bakalářské práce studenta Adama Masopusta zahájil doc. Ing. Radim Vrzal, Ph.D. Student seznámil komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudků vedoucího práce Mgr. Ivana Luptovčiaka, Ph.D. a oponenta RNDr. Petera Illése, Ph.D.
Student pak reagoval na připomínky a dotazy.
Prezentace studenta obsahovala tato témata:
Tolice vojtěška
MAPK kinázy
Metodologie práce
Příprava entry klonů a YFP-OMTK1 konstruktů - BP rekombinační reakce, ověření klonů a výběr restrikčních endonukleáz, LR rekombinační analýza a ověření klonů
Transientní transformace Nicothiana benthamiana
Detekce fúzního proteinu YFP-OMTK1 v transformovaných rostlinách
Fenotypová analýza
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
Další práce – návrh hypotéz a metod a postupů vhodných pro jejich ověření
Formální chyby zpracování a prezentace výsledků, absence popisů, odkazů na literární zdroje
Co bylo cílem přípravy entry klonů, velké množství práce není nijak diskutována, využita v práci
Rozdíl mezi fragmentem B a C, které byly použity pro přípravu entry klonů
Konstrukt 35S::eGFP:cOMTK1
Negativní kontrola – vhodný vektor, důvod použití A. tumefaciens s konstruktem p19
Velikosti predikovaných fragmentů štěpení vybraných plazmidů – vhodnost použití plasmidu s atypickým restrikčním fragmentem pro další experimenty
Signál fúzního proteinu a apoptická tělíska
Student na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagoval adekvátně, se znalostí problematiky.