Informace o kvalifikační práci Mikroskopická analýza tubulinového cytoskeletu v adventivních kořenech vojtěšky seté (Medicago sativa L.) a příprava nových markerů tubulinu s eGFP pod různými promotory
- Všechny požadované údaje o této VŠKP jsou vyplněny.
Hlavní téma
Mikroskopická analýza tubulinového cytoskeletu v adventivních kořenech vojtěšky seté (Medicago sativa L.) a příprava nových markerů tubulinu s eGFP pod různými promotory
Hlavní téma v angličtině
Microscopic analysis of tubulin cytoskeleton in Alfalfa (Medicago sativa L.) adventitious roots and preparation of new tubulin markers with eGFP under different promoters
Název dle studenta
Mikroskopická analýza tubulinového cytoskeletu v adventivních kořenech vojtěšky seté (Medicago sativa L.) a příprava nových markerů tubulinu s eGFP pod různými promotory
Název dle studenta v angličtině
Microscopic analysis of tubulin cytoskeleton in Alfalfa (Medicago sativa L.) adventitious roots and preparation of new tubulin markers with eGFP under different promotores
Medicago sativa je významná zemědělská plodina, která dokáže symbioticky interagovat s půdními bakteriemi Rhizobium. Tyto interakce jsou velmi důležité především díky potenciálu M. sativa obohacovat půdu o dusík, který ze symbiózy získává. Celého procesu symbiotické interakce se účastní rostlinný cytoskelet, který podléhá neustálé reorganizaci během jednotlivých fází interakce. Pro studium dynamiky cytoskeletu jsou využívány geneticky-kodované fluorescenční markery, které umožňují jeho vizualizaci in vivo. Tyto markery je možné připravit metodami molekulární biologie a transformovat do rostlin, ve kterých je po regeneraci možné cytoskelet vizualizovat. M. sativa bývá často regenerována a propagována somatickou embryogenezí, která je velmi časově náročná. Z tohoto důvodu byla pro vegetativní propagaci M. sativa v diplomové práci optimalizovaná a ověřená poměrně rychlá a snadná metoda rozmnožování rostlin indukcí tvorby adventivních kořenů na stonkových odřezcích. V adventivních kořenech rostlin exprimujících molekulární fluorescenční marker pro mikrotubuly byla provedena mikroskopická analýza organizace mikrotubulů. Také byla potvrzena symbiotická interakce adventivních kořenů s bakteriemi Sinorhizobium meliloti. Dalším cílem práce byla příprava nových tubulinových markerů s genem eGFP pod kontrolou třech konstitutivních promotorů p35S, pEF1 a pUBQ10 pro optimalizaci exprese markerů v transformovaných rostlinných buňkách a zvýšení jejich exprese v symbiotických hlízkách. Nové markery byly ověřeny pomocí tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana. Následnou statistickou analýzou byla zjištěna mnohem vyšší intenzita fluorescence nových markerů oproti dříve připraveným markerům s genem GFP.
Anotace v angličtině
Medicago sativa is an important agricultural crop that can symbiotically interact with soil bacteria called rhizobia. This interaction is very useful mainly due to the potential of M. sativa to enrich soil with nitrogen obtained from the symbiosis. The entire process of symbiotic interaction involves plant cytoskeleton, which undergoes constant reorganization during different phases of the interaction. To study cytoskeletal dynamics, genetically encoded fluorescent markers enabling its visualization in vivo are frequently used. Such markers can be prepared using molecular biology methods and subsequently transformed into plants, where the cytoskeleton can be visualized. M. sativa is often regenerated and propagated via somatic embryogenesis, which is very time-consuming and laborious. For this reason, a relatively quick and easy method for vegetative propagation of M. sativa plants by inducing the formation of adventitious roots on stem cuttings was optimalized and tested in the thesis. Next, microscopic analysis of microtubule organization and dynamics was performed in adventitious roots of plants expressing molecular fluorescent marker for microtubules. Additionally, a symbiotic interaction of adventitious roots with Sinorhizobium meliloti was observed. Another aim of the thesis was to prepare new tubulin markers containing eGFP gene under the control of three constitutive promoters p35S, pEF1 and pUBQ10 to optimalize expression of these markers in transformed alfalfa cells and tissues and also to enhance expression in symbiotic nodules. New markers were verified using transient expression in Nicotiana benthamiana leaves. Subsequent statistical analysis revealed a much higher fluorescence intensity of the new markers compared to previously-prepared markers with the GFP gene
Medicago sativa je významná zemědělská plodina, která dokáže symbioticky interagovat s půdními bakteriemi Rhizobium. Tyto interakce jsou velmi důležité především díky potenciálu M. sativa obohacovat půdu o dusík, který ze symbiózy získává. Celého procesu symbiotické interakce se účastní rostlinný cytoskelet, který podléhá neustálé reorganizaci během jednotlivých fází interakce. Pro studium dynamiky cytoskeletu jsou využívány geneticky-kodované fluorescenční markery, které umožňují jeho vizualizaci in vivo. Tyto markery je možné připravit metodami molekulární biologie a transformovat do rostlin, ve kterých je po regeneraci možné cytoskelet vizualizovat. M. sativa bývá často regenerována a propagována somatickou embryogenezí, která je velmi časově náročná. Z tohoto důvodu byla pro vegetativní propagaci M. sativa v diplomové práci optimalizovaná a ověřená poměrně rychlá a snadná metoda rozmnožování rostlin indukcí tvorby adventivních kořenů na stonkových odřezcích. V adventivních kořenech rostlin exprimujících molekulární fluorescenční marker pro mikrotubuly byla provedena mikroskopická analýza organizace mikrotubulů. Také byla potvrzena symbiotická interakce adventivních kořenů s bakteriemi Sinorhizobium meliloti. Dalším cílem práce byla příprava nových tubulinových markerů s genem eGFP pod kontrolou třech konstitutivních promotorů p35S, pEF1 a pUBQ10 pro optimalizaci exprese markerů v transformovaných rostlinných buňkách a zvýšení jejich exprese v symbiotických hlízkách. Nové markery byly ověřeny pomocí tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana. Následnou statistickou analýzou byla zjištěna mnohem vyšší intenzita fluorescence nových markerů oproti dříve připraveným markerům s genem GFP.
Anotace v angličtině
Medicago sativa is an important agricultural crop that can symbiotically interact with soil bacteria called rhizobia. This interaction is very useful mainly due to the potential of M. sativa to enrich soil with nitrogen obtained from the symbiosis. The entire process of symbiotic interaction involves plant cytoskeleton, which undergoes constant reorganization during different phases of the interaction. To study cytoskeletal dynamics, genetically encoded fluorescent markers enabling its visualization in vivo are frequently used. Such markers can be prepared using molecular biology methods and subsequently transformed into plants, where the cytoskeleton can be visualized. M. sativa is often regenerated and propagated via somatic embryogenesis, which is very time-consuming and laborious. For this reason, a relatively quick and easy method for vegetative propagation of M. sativa plants by inducing the formation of adventitious roots on stem cuttings was optimalized and tested in the thesis. Next, microscopic analysis of microtubule organization and dynamics was performed in adventitious roots of plants expressing molecular fluorescent marker for microtubules. Additionally, a symbiotic interaction of adventitious roots with Sinorhizobium meliloti was observed. Another aim of the thesis was to prepare new tubulin markers containing eGFP gene under the control of three constitutive promoters p35S, pEF1 and pUBQ10 to optimalize expression of these markers in transformed alfalfa cells and tissues and also to enhance expression in symbiotic nodules. New markers were verified using transient expression in Nicotiana benthamiana leaves. Subsequent statistical analysis revealed a much higher fluorescence intensity of the new markers compared to previously-prepared markers with the GFP gene
Transgenoze rostlin se zaměřením na Medicago sativa.
Všeobecný popis promotorů genů. Promotory využívané pro přípravu transgenních rostlin.
Promotory při studiu symbiotických interakcí luštěnin se symbiotickými bakteriemi.
Organizace cytoskeletu během symbiotických interakcí M. sativa s bakteriemi rodu Sinorhizobium.
Metody kvantitativní analýzy mikrotubulů.
Experimentální část:
Ověření metody zakořenění stonkových odřezků M. sativa pro indukci tvorby adventivních kořenů.
Mikroskopická analýza adventivních kořenů transgenních linií M. sativa s tubulinovými markery a studium organizace mikrotubulů.
Mikroskopie adventivních kořenů M. sativa během symbiotické interakce se Sinorhizobiem meliloti.
Příprava fluorescenčních markerů pro tubulin alfa s eGFP pod kontrolou 3 různých typů konstitutivních promotorů.
Tranzientní transformace rostlin Nicotiana benthamiana pro ověření nových fluorescenčních markerů pro tubulin alfa s eGFP pod kontrolou 3 různých typů konstitutivních promotorů.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Zásady pro vypracování
Vypracování literární rešerše na témata:
Indukce tvorby adventivních kořenů.
Transgenoze rostlin se zaměřením na Medicago sativa.
Všeobecný popis promotorů genů. Promotory využívané pro přípravu transgenních rostlin.
Promotory při studiu symbiotických interakcí luštěnin se symbiotickými bakteriemi.
Organizace cytoskeletu během symbiotických interakcí M. sativa s bakteriemi rodu Sinorhizobium.
Metody kvantitativní analýzy mikrotubulů.
Experimentální část:
Ověření metody zakořenění stonkových odřezků M. sativa pro indukci tvorby adventivních kořenů.
Mikroskopická analýza adventivních kořenů transgenních linií M. sativa s tubulinovými markery a studium organizace mikrotubulů.
Mikroskopie adventivních kořenů M. sativa během symbiotické interakce se Sinorhizobiem meliloti.
Příprava fluorescenčních markerů pro tubulin alfa s eGFP pod kontrolou 3 různých typů konstitutivních promotorů.
Tranzientní transformace rostlin Nicotiana benthamiana pro ověření nových fluorescenčních markerů pro tubulin alfa s eGFP pod kontrolou 3 různých typů konstitutivních promotorů.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Seznam doporučené literatury
Ivanov S, Harrison MJ (2014) A set of fluorescent protein-based markers expressed from constitutive and arbuscular mycorrhiza-inducible promoters to label organelles, membranes and cytoskeletal elements in Medicago truncatula. Plant J 80, 1151-1163.
Auriac MC, Timmers AC (2007) Nodulation studies in the model legume Medicagotruncatula: advantages of using the constitutive EF1alpha promoter and limitations in detecting fluorescent reporter proteins in nodule tissues. Mol Plant Microbe Interact 20, 1040-1047.
Shah SH, Jan SA, Ahmad N, Khan SU, Kumar T, Iqbal A, Nasir F, Nouman M, Uzma, Ali A (2015) Use of different promoters in transgenic plant development: current challenges and future perspectives. AEJAES 15, 664-675.
Fournier J, Timmers ACJ, Sieberer BJ, Jauneau A, Chabaud M, Barker DG (2008) Mechanism of infection thread elongation in root hairs of Medicago truncatula and dynamic interplay with associated Rhizobial colonization. Plant Physiol 148, 1985-1995.
Kitaeva AB, Demchenko KN, Tikhonovich IA, Timmers AC, Tsyganov VE (2016) Comparative analysis of the tubulin cytoskeleton organization in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum: bacterial release and bacteroid positioning correlate with characteristic microtubule rearrangements. New Phytol 210, 168-183.
Tichá M, Illésová P, Hrbáčková M, Basheer J, Novák D, Hlaváčková K, Šamajová O, Niehaus K, Ovečka M, Šamaj J (2020) Tissue culture, genetic transformation, interaction with beneficial microbes, and modern bio-imaging techniques in alfalfa research. Crit Rev Biotechnol 40, 1265-1280.
Timmers ACJ (2008) The role of the plant cytoskeleton in the interaction between legumes and rhizobia. J Microsc 231, 247-256.
Higaki T (2017) Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphology 29, 15-21.
Ovečka M, Sojka J, Tichá M, Komis G, Basheer J, Marchetti C, Šamajová O, Kuběnová L, Šamaj J (2022) Imaging plant cells and organs with light-sheet and super-resolution microscopy. Plant Physiol 188, 683-702.
Seznam doporučené literatury
Ivanov S, Harrison MJ (2014) A set of fluorescent protein-based markers expressed from constitutive and arbuscular mycorrhiza-inducible promoters to label organelles, membranes and cytoskeletal elements in Medicago truncatula. Plant J 80, 1151-1163.
Auriac MC, Timmers AC (2007) Nodulation studies in the model legume Medicagotruncatula: advantages of using the constitutive EF1alpha promoter and limitations in detecting fluorescent reporter proteins in nodule tissues. Mol Plant Microbe Interact 20, 1040-1047.
Shah SH, Jan SA, Ahmad N, Khan SU, Kumar T, Iqbal A, Nasir F, Nouman M, Uzma, Ali A (2015) Use of different promoters in transgenic plant development: current challenges and future perspectives. AEJAES 15, 664-675.
Fournier J, Timmers ACJ, Sieberer BJ, Jauneau A, Chabaud M, Barker DG (2008) Mechanism of infection thread elongation in root hairs of Medicago truncatula and dynamic interplay with associated Rhizobial colonization. Plant Physiol 148, 1985-1995.
Kitaeva AB, Demchenko KN, Tikhonovich IA, Timmers AC, Tsyganov VE (2016) Comparative analysis of the tubulin cytoskeleton organization in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum: bacterial release and bacteroid positioning correlate with characteristic microtubule rearrangements. New Phytol 210, 168-183.
Tichá M, Illésová P, Hrbáčková M, Basheer J, Novák D, Hlaváčková K, Šamajová O, Niehaus K, Ovečka M, Šamaj J (2020) Tissue culture, genetic transformation, interaction with beneficial microbes, and modern bio-imaging techniques in alfalfa research. Crit Rev Biotechnol 40, 1265-1280.
Timmers ACJ (2008) The role of the plant cytoskeleton in the interaction between legumes and rhizobia. J Microsc 231, 247-256.
Higaki T (2017) Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphology 29, 15-21.
Ovečka M, Sojka J, Tichá M, Komis G, Basheer J, Marchetti C, Šamajová O, Kuběnová L, Šamaj J (2022) Imaging plant cells and organs with light-sheet and super-resolution microscopy. Plant Physiol 188, 683-702.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího diplomové práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.: Kde konkrétně se v proteinu GFP nachází mutace? Jak byste v kořenových hlízkách odlišila mrtvé buňky od živých?
doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.: Jaká je Vaše představa ideální markerové linie pro studium mikrotubulů?
Mgr. Petr Dvořák, Ph.D.: Jaký je rozdíl mezi GFP a eGFP? Je dostupná lepší fluorescenční značka než eGFP