Disertační práce je zaměřena na vyzkum oxidačně-redukčních přeměn proteinů. Byl zkoumán
cytochrom c izolovany z koňského a telecího srdce. Z těchto vzorků byl dále připraven
apocytochrom c a porfyrincytochrom c, jejichž oxidačně-redukční chování bylo porovnáno
s nativním proteinem. Elektrochemická data byla doplněna o vysledky elektronové
paramagnetické rezonanční spektroskopie (EPR) a imunochemické analyzy. Kromě proteinů,
které jsou dobře rozpustné ve vodném prostředí, jsem dále zkoumal membránové proteiny
Na+/K+ ATPázu a Ca2+ ATPázu. Na+/K+ ATPasa byla izolována z vepřovych ledvin a
modifikována methylglyoxalem (MGO). Následné strukturní změny byly detegovány
elektrochemicky a pomocí peptidového mapování byly identifikovány konkrétní modifikace
aminokyselinovych (aa) zbytků. Byl také pozorován inhibiční účinek MGO na enzym
solubilizovany pomocí detergentu i inkorporovany do liposomů. Vliv dikarbonylovych
vedlejších produktů metabolismu byl také zkoumán u Ca2+ ATPasy izolované z králičího svalu.
Zde byla porovnána inhibiční aktivita tří látek. Látky jsou seřazeny od nejsilnějšího inhibičního
účinku, methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglukoson. Pro vyše uvedené studie byla využita
chronopotenciometrická rozpouštěcí analyza konstantním proudem s rtuťovou kapkovou visící
pracovní elektrodou. Sledováno bylo katalytické vylučování vodíku, za které odpovídají Cys,
Lys, Arg, His aminokyselinové zbytky. Katalytické vylučování vodíku bylo také pozorováno u
His obsahujících peptidů označovanych jako "H-drátky". U peptidu Ala3-(His-Ala2)6 byla
zjištěna stabilizace -helikální struktury trifluorethanolem. Tyto vysledky byly potvrzeny
pomocí NMR a CD spektrometrií. V závěrečné fázi doktorského studia byly zkoumány klinické
vzorky pacientů. Byl izolován lidsky sérovy albumin (HSA) z krve zdravych jedinců a měřena
jeho elektrokatalytická aktivita. Interindividuální variabilita ve vzorcích izolovanych z krve
zdravych jedinců vztažená na komerčně dostupny standard HSA pomocí variačního
koeficientu, ktery byl 8,5 %. Tato hodnota byla vypočítána z rozdílů v elektrochemické odezvě
vzorků izolovaného HSA od jednotlivych dárců. Také byla zkonstruována průtočná
elektrochemická cela s pracovní elektrodou vyrobenou z uhlíkového mikrovlákna. Pomocí této
techniky byl sledován ampérometricky signál vzorků lidského séra odrážející celkovou
antioxidační (elektron-donorovou) kapacitu jednotlivych vzorků.
Annotation in English
The dissertation thesis is focused on the research of redox transformations of proteins.
Cytochrome c isolated from the horse and calf heart were investigated. Apocytochrome c and
porphyrincytochrome c were further prepared. Then redox behaviors of modified cytochromes
c were compared with the native protein. Electrochemical data were supplemented with results
of electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) and immunochemical analysis. In
addition to proteins that are well soluble in aqueous media, I also studied the membrane proteins
Na+/K+ ATPase and Ca2+ ATPase. Na+/K+ ATPase was isolated from pork kidneys and
modified with methylglyoxal (MGO). Subsequent structural changes were detected
electrochemically and, specific modifications of amino acid residues were identified using
peptide mapping. The inhibitory effect of MGO on both detergent solubilized and incorporated
enzymes into liposomes was also observed. The effect of dicarbonyl by-products of metabolism
has also been investigated in Ca2+ ATPase isolated from rabbit muscle. Here the inhibitory
activity of three compounds were compared. Inhibitory activity was ranked from strongest to
weakest: methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglucosone. For the above studies, constant
current chronopotentiometric striping analysis with a mercury electrode was used. Catalytic
hydrogen evolution was monitored. Lys, Arg, His and Cys residues are responsible for this
electrochemical process. Catalytic hydrogen evolution has also been observed in His-containing
peptides referred to as "H-wires". In peptide Ala3-(His-Ala2)6, stabilization of its -helical
structure by trifluoroethanol was observed. These results were further confirmed using NMR
and CD spectroscopy. Finally, clinical samples of healthy volunteers were examined. Human
serum albumin (HSA) was isolated from the blood of healthy volunteers and its electrocatalytic
activity was measured. The interindividual variability in samples isolated from healthy
volunteers in comparison with the commercially available HSA standard was determined by
variation coefficient 8.5 %. This value was calculated from differences in the electrochemical
responses of isolated HSA samples from each healthy volunteer. An electrochemical cell for
flow injection analysis with a working electrode made of carbon microfiber was also
constructed. Using this technique, the amperometric signal of human serum samples was
monitored and the total antioxidant capacity of individual samples was evaluated.
proteins, electrochemistry, protein analysis, protein isolation, protein purification
Length of the covering note
129
Language
CZ
Annotation
Disertační práce je zaměřena na vyzkum oxidačně-redukčních přeměn proteinů. Byl zkoumán
cytochrom c izolovany z koňského a telecího srdce. Z těchto vzorků byl dále připraven
apocytochrom c a porfyrincytochrom c, jejichž oxidačně-redukční chování bylo porovnáno
s nativním proteinem. Elektrochemická data byla doplněna o vysledky elektronové
paramagnetické rezonanční spektroskopie (EPR) a imunochemické analyzy. Kromě proteinů,
které jsou dobře rozpustné ve vodném prostředí, jsem dále zkoumal membránové proteiny
Na+/K+ ATPázu a Ca2+ ATPázu. Na+/K+ ATPasa byla izolována z vepřovych ledvin a
modifikována methylglyoxalem (MGO). Následné strukturní změny byly detegovány
elektrochemicky a pomocí peptidového mapování byly identifikovány konkrétní modifikace
aminokyselinovych (aa) zbytků. Byl také pozorován inhibiční účinek MGO na enzym
solubilizovany pomocí detergentu i inkorporovany do liposomů. Vliv dikarbonylovych
vedlejších produktů metabolismu byl také zkoumán u Ca2+ ATPasy izolované z králičího svalu.
Zde byla porovnána inhibiční aktivita tří látek. Látky jsou seřazeny od nejsilnějšího inhibičního
účinku, methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglukoson. Pro vyše uvedené studie byla využita
chronopotenciometrická rozpouštěcí analyza konstantním proudem s rtuťovou kapkovou visící
pracovní elektrodou. Sledováno bylo katalytické vylučování vodíku, za které odpovídají Cys,
Lys, Arg, His aminokyselinové zbytky. Katalytické vylučování vodíku bylo také pozorováno u
His obsahujících peptidů označovanych jako "H-drátky". U peptidu Ala3-(His-Ala2)6 byla
zjištěna stabilizace -helikální struktury trifluorethanolem. Tyto vysledky byly potvrzeny
pomocí NMR a CD spektrometrií. V závěrečné fázi doktorského studia byly zkoumány klinické
vzorky pacientů. Byl izolován lidsky sérovy albumin (HSA) z krve zdravych jedinců a měřena
jeho elektrokatalytická aktivita. Interindividuální variabilita ve vzorcích izolovanych z krve
zdravych jedinců vztažená na komerčně dostupny standard HSA pomocí variačního
koeficientu, ktery byl 8,5 %. Tato hodnota byla vypočítána z rozdílů v elektrochemické odezvě
vzorků izolovaného HSA od jednotlivych dárců. Také byla zkonstruována průtočná
elektrochemická cela s pracovní elektrodou vyrobenou z uhlíkového mikrovlákna. Pomocí této
techniky byl sledován ampérometricky signál vzorků lidského séra odrážející celkovou
antioxidační (elektron-donorovou) kapacitu jednotlivych vzorků.
Annotation in English
The dissertation thesis is focused on the research of redox transformations of proteins.
Cytochrome c isolated from the horse and calf heart were investigated. Apocytochrome c and
porphyrincytochrome c were further prepared. Then redox behaviors of modified cytochromes
c were compared with the native protein. Electrochemical data were supplemented with results
of electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) and immunochemical analysis. In
addition to proteins that are well soluble in aqueous media, I also studied the membrane proteins
Na+/K+ ATPase and Ca2+ ATPase. Na+/K+ ATPase was isolated from pork kidneys and
modified with methylglyoxal (MGO). Subsequent structural changes were detected
electrochemically and, specific modifications of amino acid residues were identified using
peptide mapping. The inhibitory effect of MGO on both detergent solubilized and incorporated
enzymes into liposomes was also observed. The effect of dicarbonyl by-products of metabolism
has also been investigated in Ca2+ ATPase isolated from rabbit muscle. Here the inhibitory
activity of three compounds were compared. Inhibitory activity was ranked from strongest to
weakest: methylglyoxal >> glyoxal > 3-deoxyglucosone. For the above studies, constant
current chronopotentiometric striping analysis with a mercury electrode was used. Catalytic
hydrogen evolution was monitored. Lys, Arg, His and Cys residues are responsible for this
electrochemical process. Catalytic hydrogen evolution has also been observed in His-containing
peptides referred to as "H-wires". In peptide Ala3-(His-Ala2)6, stabilization of its -helical
structure by trifluoroethanol was observed. These results were further confirmed using NMR
and CD spectroscopy. Finally, clinical samples of healthy volunteers were examined. Human
serum albumin (HSA) was isolated from the blood of healthy volunteers and its electrocatalytic
activity was measured. The interindividual variability in samples isolated from healthy
volunteers in comparison with the commercially available HSA standard was determined by
variation coefficient 8.5 %. This value was calculated from differences in the electrochemical
responses of isolated HSA samples from each healthy volunteer. An electrochemical cell for
flow injection analysis with a working electrode made of carbon microfiber was also
constructed. Using this technique, the amperometric signal of human serum samples was
monitored and the total antioxidant capacity of individual samples was evaluated.
