Informace o kvalifikační práci Sledování transkripční aktivity aryl uhlovodíkového receptoru s využitím nové stabilně transfekované reportérové linie odvozené od HaCat buněk
Tato bakalářská práce se zabývá sledováním transkripční aktivity aryl uhlovodíkového receptoru s využitím nové stabilně transfekované reportérové linie odvozené od kožních buněk HaCat. V teoretické části jsou přiblíženy reportérové systémy a jejich geny, které se používají. Následně se také teoretická část zabývá aryl uhlovodíkovým receptorem (AhR), je zde popsána struktura, ligandy, které AhR aktivují. V neposlední řadě jsou zmíněny i srovnání AhR reportérových systémů, které jsou dostupné.
V praktické části bylo nejdříve důležité stanovit koncentrační rozmezí látek, které by nebyly pro danou buněčnou linii toxické a následně toto koncentrační rozmezí bylo použito pro sledování transkripční aktivity AhR v buněčné linii. Buňky AhRaCat byly vystaveny působení látek a byla sledována jejich proliferační aktivita pomocí krystalové violeti. Následně byly buňky podrobeny luciferázové reportérové eseji, pomocí které byla zjištěna transkripční aktivita AhR, dále byla stanovena transkripční aktivita AhR v závislosti na čase a také v přítomnosti antagonistů. V neposlední řadě bylo sledováno udržení inducibility
po dlouhodobém udržování buněk v kultivačním médiu.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis looks at monitoring the transcription aktivity of the aryl hydrocarbon receptor with using a new stable transfected reporter linie derived from HaCat skin cells.
In the theoretical part are approached reporters systém and their genes that are used. Subsequently, the theoretical part asle deals with the aryl hydrocarbon receptor (AhR), describing the structure, ligands, that activate AhR. Last but not least, comparisons of the AhR reporter´s systems available are also mentioned.
In the practical part, it was first important to establish concentration ranges of substances that would not be toxic to a given cell line and then this concentration range was used to monitor AhR transription aktivity in the cell line. AhRaCat cells, were exposed to the substances
and their proliferation aktivity was monitored using cryslat violet. Subsequently, the cells were subjected by luciferase reporters assay by which AhR transcription aktivity was detected, AhR transctiption aktivity was furter determined depending on the time and also in the presence of antagonists. Last but not least, the maintenance of inducibility after the long-term maintenance of cells in the culture medium was monitored.
Tato bakalářská práce se zabývá sledováním transkripční aktivity aryl uhlovodíkového receptoru s využitím nové stabilně transfekované reportérové linie odvozené od kožních buněk HaCat. V teoretické části jsou přiblíženy reportérové systémy a jejich geny, které se používají. Následně se také teoretická část zabývá aryl uhlovodíkovým receptorem (AhR), je zde popsána struktura, ligandy, které AhR aktivují. V neposlední řadě jsou zmíněny i srovnání AhR reportérových systémů, které jsou dostupné.
V praktické části bylo nejdříve důležité stanovit koncentrační rozmezí látek, které by nebyly pro danou buněčnou linii toxické a následně toto koncentrační rozmezí bylo použito pro sledování transkripční aktivity AhR v buněčné linii. Buňky AhRaCat byly vystaveny působení látek a byla sledována jejich proliferační aktivita pomocí krystalové violeti. Následně byly buňky podrobeny luciferázové reportérové eseji, pomocí které byla zjištěna transkripční aktivita AhR, dále byla stanovena transkripční aktivita AhR v závislosti na čase a také v přítomnosti antagonistů. V neposlední řadě bylo sledováno udržení inducibility
po dlouhodobém udržování buněk v kultivačním médiu.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis looks at monitoring the transcription aktivity of the aryl hydrocarbon receptor with using a new stable transfected reporter linie derived from HaCat skin cells.
In the theoretical part are approached reporters systém and their genes that are used. Subsequently, the theoretical part asle deals with the aryl hydrocarbon receptor (AhR), describing the structure, ligands, that activate AhR. Last but not least, comparisons of the AhR reporter´s systems available are also mentioned.
In the practical part, it was first important to establish concentration ranges of substances that would not be toxic to a given cell line and then this concentration range was used to monitor AhR transription aktivity in the cell line. AhRaCat cells, were exposed to the substances
and their proliferation aktivity was monitored using cryslat violet. Subsequently, the cells were subjected by luciferase reporters assay by which AhR transcription aktivity was detected, AhR transctiption aktivity was furter determined depending on the time and also in the presence of antagonists. Last but not least, the maintenance of inducibility after the long-term maintenance of cells in the culture medium was monitored.
1) Literární rešerše zaměřující se na in vitro experimentální reportérové systémy 2) Stanovení proliferační aktivity buněk pomocí krystalové violeti 3) Dose-response analýza vybraných modelových aktivátorů AhR po 4, 24 a 48 hod 4) Časová analýza transkripční aktivity AhR v rozmezí 2 - 24 hod 5) Sledování transkripční aktivity AhR po zamražení a rozmražení buněk 6) Zpracování literární rešerše, vyhodnocení výsledků a jejich interpretace
Zásady pro vypracování
1) Literární rešerše zaměřující se na in vitro experimentální reportérové systémy 2) Stanovení proliferační aktivity buněk pomocí krystalové violeti 3) Dose-response analýza vybraných modelových aktivátorů AhR po 4, 24 a 48 hod 4) Časová analýza transkripční aktivity AhR v rozmezí 2 - 24 hod 5) Sledování transkripční aktivity AhR po zamražení a rozmražení buněk 6) Zpracování literární rešerše, vyhodnocení výsledků a jejich interpretace
Seznam doporučené literatury
Novotna et al., Novel stably transfected gene reporter human hepatoma cell line for assessment of aryl hydrocarbon receptor transcriptional activity: construction and characterization. Environ Sci Technol. 2011 Dec 1;45(23):10133-9.
Novotna et a., Construction and characterization of a reporter gene cell line for assessment of human glucocorticoid receptor activation. Eur J Pharm Sci. 2012 Dec 18;47(5):842-7.
Bartonkova et al., Novel stably transfected human reporter cell line AIZ-AR as a tool for an assessment of human androgen receptor transcriptional activity. PLoS One. 2015. Paguio A. et al., Improved dual-luciferase reporter assays for nuclear receptors. Curr Chem Genomics. 2010;4:43-9.
Zwart et al., High-Throughput Effect-Directed Analysis Using Downscaled in Vitro Reporter Gene Assays To Identify Endocrine Disruptors in Surface Water. Environ Sci Technol. 2018 Apr 3; 52(7): 4367–4377.
Wider D and Picard D., Secreted dual reporter assay with Gaussia luciferase and the red fluorescent protein mCherry. PLoS One. 2017; 12(12): e0189403
Seznam doporučené literatury
Novotna et al., Novel stably transfected gene reporter human hepatoma cell line for assessment of aryl hydrocarbon receptor transcriptional activity: construction and characterization. Environ Sci Technol. 2011 Dec 1;45(23):10133-9.
Novotna et a., Construction and characterization of a reporter gene cell line for assessment of human glucocorticoid receptor activation. Eur J Pharm Sci. 2012 Dec 18;47(5):842-7.
Bartonkova et al., Novel stably transfected human reporter cell line AIZ-AR as a tool for an assessment of human androgen receptor transcriptional activity. PLoS One. 2015. Paguio A. et al., Improved dual-luciferase reporter assays for nuclear receptors. Curr Chem Genomics. 2010;4:43-9.
Zwart et al., High-Throughput Effect-Directed Analysis Using Downscaled in Vitro Reporter Gene Assays To Identify Endocrine Disruptors in Surface Water. Environ Sci Technol. 2018 Apr 3; 52(7): 4367–4377.
Wider D and Picard D., Secreted dual reporter assay with Gaussia luciferase and the red fluorescent protein mCherry. PLoS One. 2017; 12(12): e0189403
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu bakalářské práce studentky Lucie Rogožanové zahájil prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudků vedoucí práce Mgr. Anety Grycové, Ph.D. a oponentky Mgr. Anety Vrzalové, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
Aryl uhlovodíkový receptor – výskyt, funkce, lokalizace v buňce
Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
Mechanismy, kterými AhR přispívá ke správné funkci kožní bariéry; faktory kožní bariéru narušující
Aktivace AhR v závislosti na TCDD
Lék nově používaný na léčbu psoriázy v USA – účinná látka a molekulární cíle
Depletované médium a jeho použití v experimentech
Rozdíly v účincích antagonistů na transkripční aktivitu AhR v kombinaci s modelovými ligandy
Studentka na dotazy položené oponentkou práce a členy komise reagovala přiměřeně.