Reaktivní formy kyslíku patří k významným signálním molekulám, které se zapojují do mnoha procesů v rostlinných buňkách, jako jsou odpovědi na stres nebo diferenciace, a proto je jejich studium velmi důležité k pochopení těchto procesů. Ukázalo se také, že jsou nepostradatelné při polárním růstu rostlinných buněk. Skvělým modelovým systémem polárního růstu u rostlin jsou díky rychlosti růstu a snadné vizualizaci kořenové vlásky. V této práci byly aplikovány fluorescenční sondy CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent v kombinaci s pokročilou mikroskopií k časovým a distribučním studiím reaktivních forem kyslíku v kořenových vláscích A. thaliana. Byly použity kontrolní linie Columbia a C24, ale také mutantní linie rhd2-1 s narušenou funkcí NADPH oxidasy, zodpovědné za tvorbu ROS v kořenových vláscích, a der1-3, která má jednobodovou mutaci v genu pro vegetativní isoformu aktinu. Obě mutace vedou k fenotypu velmi krátkých kořenových vlásků. Významným úspěchem v této práci byla aplikace sond CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent pro pozorování v rostoucích kořenových vláscích in vivo, protože nejsou tradičně při studiu rostlinných buněk využívány. Výrazné rozdíly v hladinách ROS byly zjištěny u linie rhd2-1, ale taktéž mezi kontrolními ekotypy. Pomocí sond byla blíže charakterizována lokalizace a vznik ROS v kořenových vláscích, což bylo dále podpořeno doplňkovými experimenty. Kromě toho byly připraveny fluorescenční konstrukty dvou různých superoxiddismutas, u kterých se předpokládá lokalizace a funkce v apoplastu kořenových vlásků.
Anotace v angličtině
Reactive oxygen species are important signaling molecules involved in many processes in plant cells, such as stress responses or differentiation, and therefore their study is very important for understanding these processes. They are also involved in the polar growth of plant cells. Root hairs are an excellent model system for polar growth in plants due to their rapid growth and ease of visualization. In this work, fluorescent probes CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent were applied in combination with advanced microscopy for spatio and temporal studies of reactive oxygen species in root hairs of A. thaliana. The control lines Columbia and C24 were used, but also the rhd2-1 mutant line with impaired NADPH oxidase function, responsible for ROS generation in root hairs, and der1-3, which has a single-point mutation in the gene for the vegetative isoform of actin. Both mutations lead to a phenotype of very short root hairs. An important achievement in this work was the application of the CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent probes for observation in growing root hairs in vivo, as they are not traditionally used in the study of plant cells. Significant differences in ROS levels were found in the rhd2-1 line, but also between control ecotypes. Using the probe, the localization and formation of ROS in root hairs was further characterized, which was supported by additional experiments. In addition, fluorescent constructs of two different superoxide dismutases, predicted to localize and function in the apoplast of root hairs, were prepared.
Reaktivní formy kyslíku patří k významným signálním molekulám, které se zapojují do mnoha procesů v rostlinných buňkách, jako jsou odpovědi na stres nebo diferenciace, a proto je jejich studium velmi důležité k pochopení těchto procesů. Ukázalo se také, že jsou nepostradatelné při polárním růstu rostlinných buněk. Skvělým modelovým systémem polárního růstu u rostlin jsou díky rychlosti růstu a snadné vizualizaci kořenové vlásky. V této práci byly aplikovány fluorescenční sondy CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent v kombinaci s pokročilou mikroskopií k časovým a distribučním studiím reaktivních forem kyslíku v kořenových vláscích A. thaliana. Byly použity kontrolní linie Columbia a C24, ale také mutantní linie rhd2-1 s narušenou funkcí NADPH oxidasy, zodpovědné za tvorbu ROS v kořenových vláscích, a der1-3, která má jednobodovou mutaci v genu pro vegetativní isoformu aktinu. Obě mutace vedou k fenotypu velmi krátkých kořenových vlásků. Významným úspěchem v této práci byla aplikace sond CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent pro pozorování v rostoucích kořenových vláscích in vivo, protože nejsou tradičně při studiu rostlinných buněk využívány. Výrazné rozdíly v hladinách ROS byly zjištěny u linie rhd2-1, ale taktéž mezi kontrolními ekotypy. Pomocí sond byla blíže charakterizována lokalizace a vznik ROS v kořenových vláscích, což bylo dále podpořeno doplňkovými experimenty. Kromě toho byly připraveny fluorescenční konstrukty dvou různých superoxiddismutas, u kterých se předpokládá lokalizace a funkce v apoplastu kořenových vlásků.
Anotace v angličtině
Reactive oxygen species are important signaling molecules involved in many processes in plant cells, such as stress responses or differentiation, and therefore their study is very important for understanding these processes. They are also involved in the polar growth of plant cells. Root hairs are an excellent model system for polar growth in plants due to their rapid growth and ease of visualization. In this work, fluorescent probes CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent were applied in combination with advanced microscopy for spatio and temporal studies of reactive oxygen species in root hairs of A. thaliana. The control lines Columbia and C24 were used, but also the rhd2-1 mutant line with impaired NADPH oxidase function, responsible for ROS generation in root hairs, and der1-3, which has a single-point mutation in the gene for the vegetative isoform of actin. Both mutations lead to a phenotype of very short root hairs. An important achievement in this work was the application of the CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent probes for observation in growing root hairs in vivo, as they are not traditionally used in the study of plant cells. Significant differences in ROS levels were found in the rhd2-1 line, but also between control ecotypes. Using the probe, the localization and formation of ROS in root hairs was further characterized, which was supported by additional experiments. In addition, fluorescent constructs of two different superoxide dismutases, predicted to localize and function in the apoplast of root hairs, were prepared.
1) Vyhledání literárních zdrojů a zpracování literární rešerše na dané téma zejména: a) biologie a anatomie kořene, b) polární růst rostlinných buněk, konkrétně pak vývoj a růst kořenových vlásků, c) specifikace vrcholového růstu kořenových vlásků se zřetelem na aktinový cytoskelet, tvorbu a funkce ROS, a důležitých enzymů zapojených do ROS metabolismu (NADPH oxidasy, superoxid dismutasy), d) použití vitálních fluorescenčních sond pro barvení ROS v rostlinách, zaměřené hlavně na kořenové vlásky.
2) Naučit se a samostatně zvládat základní laboratorní metody výzkumu rostlinných buněk na buněčné úrovni a využití mikroskopie.
3) Optimalizace kultivačních podmínek in vitro pro kontrolované a neinvazivní pozorování růstu kořenových vlásků pomocí moderních mikroskopických metod.
4) Příprava konstruktů pro fluorescenčně značené apoplastické isoformy SOD pomocí "Gateway" metody klonování.
5) Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocování mikroskopických dat z časových a distribučních studií růstu kořenových vlásků s naznačenými ROS.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Zásady pro vypracování
1) Vyhledání literárních zdrojů a zpracování literární rešerše na dané téma zejména: a) biologie a anatomie kořene, b) polární růst rostlinných buněk, konkrétně pak vývoj a růst kořenových vlásků, c) specifikace vrcholového růstu kořenových vlásků se zřetelem na aktinový cytoskelet, tvorbu a funkce ROS, a důležitých enzymů zapojených do ROS metabolismu (NADPH oxidasy, superoxid dismutasy), d) použití vitálních fluorescenčních sond pro barvení ROS v rostlinách, zaměřené hlavně na kořenové vlásky.
2) Naučit se a samostatně zvládat základní laboratorní metody výzkumu rostlinných buněk na buněčné úrovni a využití mikroskopie.
3) Optimalizace kultivačních podmínek in vitro pro kontrolované a neinvazivní pozorování růstu kořenových vlásků pomocí moderních mikroskopických metod.
4) Příprava konstruktů pro fluorescenčně značené apoplastické isoformy SOD pomocí "Gateway" metody klonování.
5) Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocování mikroskopických dat z časových a distribučních studií růstu kořenových vlásků s naznačenými ROS.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Seznam doporučené literatury
1) Foreman J, Dolan L (2001) Root hairs as a model system for studying plant cell growth. Ann Bot 88: 1-7
2) Grierson CS, Parker JS, Kemp AC (2001) Arabidopsis genes with roles in root hair development. J Plant Nutr Soil Sci 164:131-140
3) Grierson CS, Schiefelbein J (2002) Root Hairs. The Arabidopsis Book, eds. Somerville CR and Meyerowitz EM, American Society of Plant Biologists, Rockville, MD. doi:10.1199/tab.0060
4) Carol RJ, Dolan L (2002) Building a hair: tip growth in Arabidopsis thaliana root hairs. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357: 815?821
5) Šamaj J, Müller J, Beck M, Böhm N, Menzel D (2006) Vesicular trafficking, cytoskeleton and signalling in root hairs and pollen tubes. Trends Plant Sci 11: 594-600
6) Takeda S, Gapper C, Kaya H, Bell E, Kuchitsu K., Dolan L (2008) Local positive feedback regulation determines cell shape in root hair cells. Science 319(5867):1241-4
7) Foreman J, Demidchik V, Bothwell JHF, Mylona P, Miedema H, Torresk MA, Linstead P, Costa S, Brownlee C, Jonesk JDG, Davies JM, Dolan L (2003) Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature Vol. 422: 442-446
8) Beck BCH (2010) An introduction to plant structure and development. Plant anatomy for the twenty-first century. Cambridge: Cambridge University Press.
9) Ovečka M, Vaškebová L, Komis G, Luptovčiak I, Smertenko A, Šamaj J (2015) Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nature Protocols 10: 1234–1247
10) Ovečka M, Lang I, Baluška F, Ismail A, Illéš P, Lichtscheidl IK (2005) Endocytosis and vesicle trafficking during tip growth of root hairs. Protoplasma 226: 39–54
11) Monshausen GB, Bibikova TN, Messerli MA, Shi C, Gilroy S (2007) Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104: 20996–21001
12) Mangano S, Juárez SPD, Estevez JM (2016) ROS Regulation of Polar Growth in Plant Cells. Plant Physiology 171: 1593-1605.
13) Dvořák P, Krasylenko Y, Zeiner A, Šamaj J,Takáč T (2021) Signaling toward reactive oxygen species-scavenging enzymes in plants.Frontiers in Plant Science 11: 1153
14) Mittler R, Zandalinas SI, Fichman Y, Van Breusegem F (2022) Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 23: 663-679
15) Kuběnová L, Tichá M, Šamaj J, Ověčka M (2022) AtRBOHC/RHD2 vesicular delivery to the apical plasma membrane domain during root hair development. Plant Physiology, kiab595
16) Akter S, Khan MS, Smith EN, Flashman E (2021) Measuring ROS and redox markers in plant cells. RSC chemical biology, 2: 1384-1401
Seznam doporučené literatury
1) Foreman J, Dolan L (2001) Root hairs as a model system for studying plant cell growth. Ann Bot 88: 1-7
2) Grierson CS, Parker JS, Kemp AC (2001) Arabidopsis genes with roles in root hair development. J Plant Nutr Soil Sci 164:131-140
3) Grierson CS, Schiefelbein J (2002) Root Hairs. The Arabidopsis Book, eds. Somerville CR and Meyerowitz EM, American Society of Plant Biologists, Rockville, MD. doi:10.1199/tab.0060
4) Carol RJ, Dolan L (2002) Building a hair: tip growth in Arabidopsis thaliana root hairs. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357: 815?821
5) Šamaj J, Müller J, Beck M, Böhm N, Menzel D (2006) Vesicular trafficking, cytoskeleton and signalling in root hairs and pollen tubes. Trends Plant Sci 11: 594-600
6) Takeda S, Gapper C, Kaya H, Bell E, Kuchitsu K., Dolan L (2008) Local positive feedback regulation determines cell shape in root hair cells. Science 319(5867):1241-4
7) Foreman J, Demidchik V, Bothwell JHF, Mylona P, Miedema H, Torresk MA, Linstead P, Costa S, Brownlee C, Jonesk JDG, Davies JM, Dolan L (2003) Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature Vol. 422: 442-446
8) Beck BCH (2010) An introduction to plant structure and development. Plant anatomy for the twenty-first century. Cambridge: Cambridge University Press.
9) Ovečka M, Vaškebová L, Komis G, Luptovčiak I, Smertenko A, Šamaj J (2015) Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nature Protocols 10: 1234–1247
10) Ovečka M, Lang I, Baluška F, Ismail A, Illéš P, Lichtscheidl IK (2005) Endocytosis and vesicle trafficking during tip growth of root hairs. Protoplasma 226: 39–54
11) Monshausen GB, Bibikova TN, Messerli MA, Shi C, Gilroy S (2007) Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104: 20996–21001
12) Mangano S, Juárez SPD, Estevez JM (2016) ROS Regulation of Polar Growth in Plant Cells. Plant Physiology 171: 1593-1605.
13) Dvořák P, Krasylenko Y, Zeiner A, Šamaj J,Takáč T (2021) Signaling toward reactive oxygen species-scavenging enzymes in plants.Frontiers in Plant Science 11: 1153
14) Mittler R, Zandalinas SI, Fichman Y, Van Breusegem F (2022) Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 23: 663-679
15) Kuběnová L, Tichá M, Šamaj J, Ověčka M (2022) AtRBOHC/RHD2 vesicular delivery to the apical plasma membrane domain during root hair development. Plant Physiology, kiab595
16) Akter S, Khan MS, Smith EN, Flashman E (2021) Measuring ROS and redox markers in plant cells. RSC chemical biology, 2: 1384-1401
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc. představil studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta student zodpověděl.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc.: Je možné fluorescenční sondy pro detekci kyslíkových radikálů kombinovat? Jaké kombinace sond je možné použít?
doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.: Můžete vyhodnotit na základě vašich výsledků, zda aktin inhibuje růst kořenových vlásků přes regulaci kyslíkových radikálů? Má aktin význam pro lokalizaci NADPH oxidázy RHD2? Nemyslíte si, že by měl der1-3 mutant vykazovat snížení tvorby kyslíkových radikálů?