Teoretická část diplomové práce je zaměřena na charakterizaci reaktivních forem kyslíku a antioxidačních systémů a jejich funkci v organismech obecně. Dále se práce zaobírá NADPH a duálními oxidasami (Nox a Duox) hmyzu, především včel medonosných, a jejich úlohou v imunitě a signalizaci. Důraz byl kladen na popis imunitních procesů v trávicí soustavě, kde Nox a Duox hrají významnou roli v interakci střevního epitelu s mikroby. Poslední část literární rešerše se zabývá problematikou metod stanovení reaktivních forem kyslíku a popisem fluorescenčních prób používaných v experimentální části práce.
Experimentální část práce je zaměřena na srovnání fluorescenčních metod využívaných ke kvantifikaci H2O2 a jejich optimalizace při stanovování aktivity Nox a Duox ve vzorcích trávicí soustavy včel. Další práce byla zaměřena na kvantifikaci obsahu H2O2 v trávicí soustavě včel vystavených modelovému imunitnímu elicitoru (bakteriálním lipopolysacharidům LPS) a induktoru oxidativního stresu (herbicidu paraquatu PQ). Poslední část práce se zabývá využitím fluorescenční próby R19S k histochemické detekci produktu duálních oxidas (HClO) v trávicí soustavě včel.
Ze srovnání fluorescenčních prób vyšla jako jediná použitelná v homogenátech AmplexRed. Ta byla dále použita k měření koncentrace H2O2 v trávicích soustavách včel ovlivněných LPS a PQ. Ukázalo se, že PQ ovlivňuje tvorbu ROS pouze v prvních 2 h. Při vystavení včel LPS byla tvorba ROS závislá spíše na stáří včel; naměřené hladiny H2O2 navíc nekorelují s aktivitou Nox/Duox. Histochemickou metodou s R19S byla potvrzena tvorba HClO ve střevech včel po indukci uracilem.
Anotace v angličtině
The theoretical part of the thesis is focused on the characterization of reactive oxygen species and antioxidant systems and their function in organisms in general. Furthermore, the thesis focuses on NADPH and dual oxidases (Nox and Duox) in insects, especially honey bees, and their role in immunity and signalling. Emphasis has been placed on the description of immune processes in the digestive system, where Nox and Duox play an important role in the interactions of the intestinal epithelium with microbes. The last part of the literature review deals with the methods of reactive oxygen species determination and description of fluorescence assays used in the experimental part of the work.
The experimental part of the thesis is focused on the comparison of fluorimetric methods used for H2O2 quantification and their optimization in the determination of Nox and Duox activity in bee digestive system samples. Further work focused on the quantification of H2O2 content in the digestive system of bees exposed to a model immune elicitor (bacterial lipopolysaccharides LPS) and an inducer of oxidative stress (herbicide paraquat PQ). The last part of the thesis deals with the use of R19S as a fluorescent probe for the histochemical detection of the dual oxide product (HClO) in the digestive system of bees.
From the comparison of fluorescence assays, AmplexRed was the only one applicable in homogenates. It was further used to measure H2O2 concentrations in the digestive systems of bees affected by LPS and PQ. It was shown that PQ affects ROS production only in the first 2 h. When bees were exposed to LPS, ROS production was dependent on the age of the bees; in addition, the measured H2O2 levels do not correlate with Nox/Duox activity. The histochemical method with R19S confirmed formation of HClO in the gut of bees after induction with uracil.
Teoretická část diplomové práce je zaměřena na charakterizaci reaktivních forem kyslíku a antioxidačních systémů a jejich funkci v organismech obecně. Dále se práce zaobírá NADPH a duálními oxidasami (Nox a Duox) hmyzu, především včel medonosných, a jejich úlohou v imunitě a signalizaci. Důraz byl kladen na popis imunitních procesů v trávicí soustavě, kde Nox a Duox hrají významnou roli v interakci střevního epitelu s mikroby. Poslední část literární rešerše se zabývá problematikou metod stanovení reaktivních forem kyslíku a popisem fluorescenčních prób používaných v experimentální části práce.
Experimentální část práce je zaměřena na srovnání fluorescenčních metod využívaných ke kvantifikaci H2O2 a jejich optimalizace při stanovování aktivity Nox a Duox ve vzorcích trávicí soustavy včel. Další práce byla zaměřena na kvantifikaci obsahu H2O2 v trávicí soustavě včel vystavených modelovému imunitnímu elicitoru (bakteriálním lipopolysacharidům LPS) a induktoru oxidativního stresu (herbicidu paraquatu PQ). Poslední část práce se zabývá využitím fluorescenční próby R19S k histochemické detekci produktu duálních oxidas (HClO) v trávicí soustavě včel.
Ze srovnání fluorescenčních prób vyšla jako jediná použitelná v homogenátech AmplexRed. Ta byla dále použita k měření koncentrace H2O2 v trávicích soustavách včel ovlivněných LPS a PQ. Ukázalo se, že PQ ovlivňuje tvorbu ROS pouze v prvních 2 h. Při vystavení včel LPS byla tvorba ROS závislá spíše na stáří včel; naměřené hladiny H2O2 navíc nekorelují s aktivitou Nox/Duox. Histochemickou metodou s R19S byla potvrzena tvorba HClO ve střevech včel po indukci uracilem.
Anotace v angličtině
The theoretical part of the thesis is focused on the characterization of reactive oxygen species and antioxidant systems and their function in organisms in general. Furthermore, the thesis focuses on NADPH and dual oxidases (Nox and Duox) in insects, especially honey bees, and their role in immunity and signalling. Emphasis has been placed on the description of immune processes in the digestive system, where Nox and Duox play an important role in the interactions of the intestinal epithelium with microbes. The last part of the literature review deals with the methods of reactive oxygen species determination and description of fluorescence assays used in the experimental part of the work.
The experimental part of the thesis is focused on the comparison of fluorimetric methods used for H2O2 quantification and their optimization in the determination of Nox and Duox activity in bee digestive system samples. Further work focused on the quantification of H2O2 content in the digestive system of bees exposed to a model immune elicitor (bacterial lipopolysaccharides LPS) and an inducer of oxidative stress (herbicide paraquat PQ). The last part of the thesis deals with the use of R19S as a fluorescent probe for the histochemical detection of the dual oxide product (HClO) in the digestive system of bees.
From the comparison of fluorescence assays, AmplexRed was the only one applicable in homogenates. It was further used to measure H2O2 concentrations in the digestive systems of bees affected by LPS and PQ. It was shown that PQ affects ROS production only in the first 2 h. When bees were exposed to LPS, ROS production was dependent on the age of the bees; in addition, the measured H2O2 levels do not correlate with Nox/Duox activity. The histochemical method with R19S confirmed formation of HClO in the gut of bees after induction with uracil.
1. Vypracovat literární rešerši shrnující aktuální poznatky o vlastnostech, funkci a významu reaktivních forem kyslíku (ROS) a enzymů jejich produkce NADPH-oxidas (Nox) a duálních oxidas (Duox) v imunitě hmyzu 2. Optimalizovat metody stanovení enzymové aktivity Nox/Duox ve vzorcích tkání včel 3. Studovat změny aktivity Nox/Duox ve vzorcích včel infikovaných bakteriálními patogeny a elicitory
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Zásady pro vypracování
1. Vypracovat literární rešerši shrnující aktuální poznatky o vlastnostech, funkci a významu reaktivních forem kyslíku (ROS) a enzymů jejich produkce NADPH-oxidas (Nox) a duálních oxidas (Duox) v imunitě hmyzu 2. Optimalizovat metody stanovení enzymové aktivity Nox/Duox ve vzorcích tkání včel 3. Studovat změny aktivity Nox/Duox ve vzorcích včel infikovaných bakteriálními patogeny a elicitory
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/).
Práce bude studentem pouze vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Vnitřní norma UP č. R-B - 17/08-ÚZ01 ).
Pokud na základě žádosti bude závěrečná práce v systému Stag nezveřejněná , student odevzdá jeden svázaný výtisk ve stanoveném termínu na sekretariátu Katedry biotechnologií.
Seznam doporučené literatury
1. De Deken X et al. (2014) Roles of DUOX-Mediated Hydrogen Peroxide in Metabolism, Host Defense, and Signaling. Antioxidants & Redox Signaling 20(17), 2776-2793
2. Lambeth JD a Neish AS (2014) Nox Enzymes and New Thinking on Reactive Oxygen: A Double-Edged Sword Revisited. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 9(1), 119-145
3. Lee KA et al. (2013) Bacterial-Derived Uracil as a Modulator of Mucosal Immunity and Gut-Microbe Homeostasis in Drosophila. Cell 153, 797–811
4. Patel PH et al. (2013) Stimulating cROSstalk between commensal bacteria and intestinal stem cells. The EMBO Journal 32, 3009–3010
Seznam doporučené literatury
1. De Deken X et al. (2014) Roles of DUOX-Mediated Hydrogen Peroxide in Metabolism, Host Defense, and Signaling. Antioxidants & Redox Signaling 20(17), 2776-2793
2. Lambeth JD a Neish AS (2014) Nox Enzymes and New Thinking on Reactive Oxygen: A Double-Edged Sword Revisited. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 9(1), 119-145
3. Lee KA et al. (2013) Bacterial-Derived Uracil as a Modulator of Mucosal Immunity and Gut-Microbe Homeostasis in Drosophila. Cell 153, 797–811
4. Patel PH et al. (2013) Stimulating cROSstalk between commensal bacteria and intestinal stem cells. The EMBO Journal 32, 3009–3010
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc. představil studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta student zodpověděl.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
prof. RNDr. Jozef Šamaj DrSc.: Je možné modulovat abundanci/transkripci NADPH oxidas u hmyzu genovými modifikacemi?
doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.: Dá se vyloučit, že s výsledky měření obsahu peroxidu vodíku interferují kyslíkové radikály vznikající v mitochondriích? Jak je možné, že po přidání sueroxiddismutasy do reakční směsi při měření obsahu peroxidu vodíku, došlo k snížení jeho koncentrace?