Lucerna siata (Medicago sativa L.) patrí medzi najvýznamnejšie plodiny sveta využívané v mnohých odvetviach. Dôležitosť výskumu tohto poľnohospodársky nenahraditeľného druhu, viedla k štúdiu mitogénom aktivovaných proteín kináz (MAPK), ktoré v bunke regulujú mnohé transkripčné faktory, cytoskeletálne a ďalšie dôležité proteíny. MAPK zohrávajú kľúčovú úlohu počas rastu a vývinu rastlín ako aj pri odpovediach na zmeny v okolitom prostredí. Medzi tieto enzýmy patrí MMK2 (Medicago MAPK2), ktorá okrem účasti na signalizácii počas reakcií na stresy biotického a abiotického pôvodu, ovplyvňuje aj organizáciu cytoskeletu a biosyntézu bunkovej steny. Z doteraz publikovaných imunolokalizačných štúdií vyplynula hypotéza o možnom zapojení MMK2 počas interakcií lucerny s prospešnými baktériami. Pokiaľ ide o riešenie moderných problémov, ako je rastúci dopyt po potravinách a plodinách v meniacom sa prostredí, funkčné štúdie génu MMK2 môžu poskytnúť priestor pre ďalší výskum. Pre tento účel je nevyhnutné pripraviť transgénne rastliny s vyradením (knock-out, KO) príslušného génu. Predkladaná práca je preto zameraná na prípravu destinačných multiplexných CRISPR-KO vektorov pre mutagenézu, prakticky, akéhokoľvek génu. Pripravené boli rôzne typy destinačných vektorov, líšiacich sa systémom selekcie a expresiou nukleázy Cas9. Berúc do úvahy zložitejší spôsob získavania ďalších generácií lucerny, okrem konštitutívnej expresie Cas9, bol pripravený aj variant s inducibilným systémom. Do výsledných destinačných vektorov možno naklonovať 1 až 12 rôznych vodiacich RNA (gRNA) pre nasmerovanie mutagenézy. V rámci predkladanej bakalárskej práce bolo navrhnutých viacero gRNA pre mutagenézu génu MMK2, vrátane dizajnu primerov pre ich budúce klonovanie do príslušných akceptorových vektorov.
Anotace v angličtině
Abstract
Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the most important crops globally used in many fields of industry. The importance of research on this agriculturally irreplaceable species has led to the study of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), which regulate many transcription factors, cytoskeletal and other essential proteins. MAPKs play a key role during plant growth and development and in responding to changes in the environment. These enzymes include MMK2 (Medicago MAPK2) which, besides participating in signalling during stress responses of biotic and abiotic origin, affects the cytoskeletal organisation and cell wall biosynthesis. The published immunolocalisation studies have emerged a hypothesis about the possible involvement of MMK2 during alfalfa interactions with beneficial bacteria. Concerning solving modern problems, such as the increased demand for food and crops in a changing environment, functional studies of the MMK2 gene can provide scope for further researchs. For this purpose, it is necessary to prepare transgenic plants with knock-out (KO) of this gene. Therefore, the present thesis focuses on the preparation of destination multiplex CRISPR-KO vectors for mutagenesis of practically any gene. Different types of destination vectors have been prepared that differ in the selection system and expression of the Cas9 nuclease. Considering difficulties in producing the next alfalfa generation, in addition to the constitutive expression of Cas9, a variant with an inducible system was prepared. One to twelve different guide RNAs (gRNAs) can be cloned into the final destination vectors to direct mutagenesis. Within this bachelor thesis, several gRNAs for MMK2 gene mutagenesis have been proposed, including the design of primers for their future cloning into appropriate acceptor vectors.
Klíčová slova
Klonovanie Golden a Green Gate, Medicago sativa, multiplex CRISPR/Cas9, mitogénom aktivované proteín kinázy, vodiace RNA.
Klíčová slova v angličtině
Golden and Green Gate cloning, guide RNA, Medicago sativa, mitogen-activated protein kinases, multiplex CRISPR/Cas9.
Rozsah průvodní práce
85
Jazyk
SK
Anotace
Lucerna siata (Medicago sativa L.) patrí medzi najvýznamnejšie plodiny sveta využívané v mnohých odvetviach. Dôležitosť výskumu tohto poľnohospodársky nenahraditeľného druhu, viedla k štúdiu mitogénom aktivovaných proteín kináz (MAPK), ktoré v bunke regulujú mnohé transkripčné faktory, cytoskeletálne a ďalšie dôležité proteíny. MAPK zohrávajú kľúčovú úlohu počas rastu a vývinu rastlín ako aj pri odpovediach na zmeny v okolitom prostredí. Medzi tieto enzýmy patrí MMK2 (Medicago MAPK2), ktorá okrem účasti na signalizácii počas reakcií na stresy biotického a abiotického pôvodu, ovplyvňuje aj organizáciu cytoskeletu a biosyntézu bunkovej steny. Z doteraz publikovaných imunolokalizačných štúdií vyplynula hypotéza o možnom zapojení MMK2 počas interakcií lucerny s prospešnými baktériami. Pokiaľ ide o riešenie moderných problémov, ako je rastúci dopyt po potravinách a plodinách v meniacom sa prostredí, funkčné štúdie génu MMK2 môžu poskytnúť priestor pre ďalší výskum. Pre tento účel je nevyhnutné pripraviť transgénne rastliny s vyradením (knock-out, KO) príslušného génu. Predkladaná práca je preto zameraná na prípravu destinačných multiplexných CRISPR-KO vektorov pre mutagenézu, prakticky, akéhokoľvek génu. Pripravené boli rôzne typy destinačných vektorov, líšiacich sa systémom selekcie a expresiou nukleázy Cas9. Berúc do úvahy zložitejší spôsob získavania ďalších generácií lucerny, okrem konštitutívnej expresie Cas9, bol pripravený aj variant s inducibilným systémom. Do výsledných destinačných vektorov možno naklonovať 1 až 12 rôznych vodiacich RNA (gRNA) pre nasmerovanie mutagenézy. V rámci predkladanej bakalárskej práce bolo navrhnutých viacero gRNA pre mutagenézu génu MMK2, vrátane dizajnu primerov pre ich budúce klonovanie do príslušných akceptorových vektorov.
Anotace v angličtině
Abstract
Alfalfa (Medicago sativa L.) is one of the most important crops globally used in many fields of industry. The importance of research on this agriculturally irreplaceable species has led to the study of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), which regulate many transcription factors, cytoskeletal and other essential proteins. MAPKs play a key role during plant growth and development and in responding to changes in the environment. These enzymes include MMK2 (Medicago MAPK2) which, besides participating in signalling during stress responses of biotic and abiotic origin, affects the cytoskeletal organisation and cell wall biosynthesis. The published immunolocalisation studies have emerged a hypothesis about the possible involvement of MMK2 during alfalfa interactions with beneficial bacteria. Concerning solving modern problems, such as the increased demand for food and crops in a changing environment, functional studies of the MMK2 gene can provide scope for further researchs. For this purpose, it is necessary to prepare transgenic plants with knock-out (KO) of this gene. Therefore, the present thesis focuses on the preparation of destination multiplex CRISPR-KO vectors for mutagenesis of practically any gene. Different types of destination vectors have been prepared that differ in the selection system and expression of the Cas9 nuclease. Considering difficulties in producing the next alfalfa generation, in addition to the constitutive expression of Cas9, a variant with an inducible system was prepared. One to twelve different guide RNAs (gRNAs) can be cloned into the final destination vectors to direct mutagenesis. Within this bachelor thesis, several gRNAs for MMK2 gene mutagenesis have been proposed, including the design of primers for their future cloning into appropriate acceptor vectors.
Klíčová slova
Klonovanie Golden a Green Gate, Medicago sativa, multiplex CRISPR/Cas9, mitogénom aktivované proteín kinázy, vodiace RNA.
Klíčová slova v angličtině
Golden and Green Gate cloning, guide RNA, Medicago sativa, mitogen-activated protein kinases, multiplex CRISPR/Cas9.
Zásady pro vypracování
V rámci teoretickej časti bude vypracovaná literárna rešerš na témy:
Poľnohospodársky a biologický význam lucerny siatej (Medicago sativa L.).
Úloha mitogénom aktivovaných proteín kináz (MAPK) v rastlinách so zameraním na Medicago spp.
Prehľad signálnych dráh MAPK s dôrazom na Medicago MAPK2 (MMK2) počas vývinu a pri odpovediach na podmienky stresu.
Systém CRISPR/Cas a možnosti jeho využitia.
Editácia genómu Medicago spp. pomocou CRISPR/Cas9 technológií.
Experimentálna časť:
Zostavenie CRISPR-KO destinačných vektorov kompatibilných s jednou a viac vodiacimi RNA (guide RNA - gRNA) s nukleázou Cas9 pod kontrolou konštitutívneho alebo inducibilného promótora.
Návrh gRNA pre mutagenézu MMK2 génu pomocou multiplex CRISPR.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/)
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Katedry biotechnologií ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce
Katedry biotechnologií.( http://kbt.upol.cz )
Zásady pro vypracování
V rámci teoretickej časti bude vypracovaná literárna rešerš na témy:
Poľnohospodársky a biologický význam lucerny siatej (Medicago sativa L.).
Úloha mitogénom aktivovaných proteín kináz (MAPK) v rastlinách so zameraním na Medicago spp.
Prehľad signálnych dráh MAPK s dôrazom na Medicago MAPK2 (MMK2) počas vývinu a pri odpovediach na podmienky stresu.
Systém CRISPR/Cas a možnosti jeho využitia.
Editácia genómu Medicago spp. pomocou CRISPR/Cas9 technológií.
Experimentálna časť:
Zostavenie CRISPR-KO destinačných vektorov kompatibilných s jednou a viac vodiacimi RNA (guide RNA - gRNA) s nukleázou Cas9 pod kontrolou konštitutívneho alebo inducibilného promótora.
Návrh gRNA pre mutagenézu MMK2 génu pomocou multiplex CRISPR.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce studijního programu Biotechnologie a genové inženýrství PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biotechnologií (http://kbt.upol.cz/)
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu PDF do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Katedry biotechnologií ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce
Katedry biotechnologií.( http://kbt.upol.cz )
Seznam doporučené literatury
Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annu Rev Plant Biol 69:237-265.
Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Cross talk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnol Adv 32:2-11.
Cardinale F, Jonak C, Ligterink W, Niehaus K, Boller T, Hirt H (2000) Differential activation of four specific MAPK pathways by distinct elicitors. J Biol Chem 275:36734-36740.
Cardinale F, Meskiene I, Ouaked F, Hirt H (2002) Convergence and divergence of stress-induced mitogen-activated protein kinase signaling pathways at the level of two distinct mitogen-activated protein kinase kinases. Plant Cell 14:703-711.
Jonak C, Kiegerl S, Ligterink W, Barker PJ, Huskisson NS, Hirt H (1996). Stress signaling in plants: a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought. Proc Natl Acad Sci USA 93:11274-11279
Engler C, Youles M, Gruetzner R, Ehnert TM, Werner S, Jones JD, Patron NJ, Marillonnet S (2014) A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol 3:839-843.
Lampropoulos A, Sutikovic Z, Wenzl C, Maegele I, Lohmann JU, Forner J (2013) GreenGate - a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PloS One 8:e83043.
Doudna JA, Charpentier E (2014) Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346:1258096.
Chen K, Wang Y, Zhang R, Zhang H, Gao C (2019): CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture. Annu Rev Plant Biol 70:667-697.
Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ (2014) A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol 14:327.
Decaestecker W, Buono RA, Pfeiffer ML, Vangheluwe N, Jourquin J, Karimi M, Van Isterdael G, Beeckman T, Nowack MK, Jacobs TB (2019) CRISPR-TSKO: a technique for efficient mutagenesis in specific cell types, tissues, or organs in Arabidopsis. Plant Cell 31:2868-2887.
Hrbáčková M, Dvořák P, Takáč T, Tichá M, Luptovčiak I, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2020) Biotechnological perspectives of omics and genetic engineering methods in alfalfa. Front Plant Sci 11:592.
Seznam doporučené literatury
Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2018) Cell and developmental biology of plant mitogen-activated protein kinases. Annu Rev Plant Biol 69:237-265.
Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Šamaj J (2014) Cross talk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnol Adv 32:2-11.
Cardinale F, Jonak C, Ligterink W, Niehaus K, Boller T, Hirt H (2000) Differential activation of four specific MAPK pathways by distinct elicitors. J Biol Chem 275:36734-36740.
Cardinale F, Meskiene I, Ouaked F, Hirt H (2002) Convergence and divergence of stress-induced mitogen-activated protein kinase signaling pathways at the level of two distinct mitogen-activated protein kinase kinases. Plant Cell 14:703-711.
Jonak C, Kiegerl S, Ligterink W, Barker PJ, Huskisson NS, Hirt H (1996). Stress signaling in plants: a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought. Proc Natl Acad Sci USA 93:11274-11279
Engler C, Youles M, Gruetzner R, Ehnert TM, Werner S, Jones JD, Patron NJ, Marillonnet S (2014) A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol 3:839-843.
Lampropoulos A, Sutikovic Z, Wenzl C, Maegele I, Lohmann JU, Forner J (2013) GreenGate - a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PloS One 8:e83043.
Doudna JA, Charpentier E (2014) Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346:1258096.
Chen K, Wang Y, Zhang R, Zhang H, Gao C (2019): CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture. Annu Rev Plant Biol 70:667-697.
Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ (2014) A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol 14:327.
Decaestecker W, Buono RA, Pfeiffer ML, Vangheluwe N, Jourquin J, Karimi M, Van Isterdael G, Beeckman T, Nowack MK, Jacobs TB (2019) CRISPR-TSKO: a technique for efficient mutagenesis in specific cell types, tissues, or organs in Arabidopsis. Plant Cell 31:2868-2887.
Hrbáčková M, Dvořák P, Takáč T, Tichá M, Luptovčiak I, Šamajová O, Ovečka M, Šamaj J (2020) Biotechnological perspectives of omics and genetic engineering methods in alfalfa. Front Plant Sci 11:592.
Přílohy volně vložené
CD ROM
Přílohy vázané v práci
tabulky
Převzato z knihovny
Ne
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího bakalářské práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse student zodpověděl následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Mgr. Olga Šamajová, Dr.: Jaký bude další postup práce v případě pokračování na dané problematice?
Ing. Pavel Křenek, Ph.D.: Budou na jednom destinačním vektoru přítomny všechny čtyři gRNA a budou řízeny jedním promotorem? Mohla byste popsat, jakým způsobem může CRISPR/Cas9 vyřadit gen?
prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D.: Očekáváte komplikace při selekci mutantů?