Vzhledem k rostoucímu počtu pacientů s různými formami demence spojenými s patologií tau je zásadní zvolit spolehlivý model pro studium mechanismů třídění, výsevu a tvorby patologických proteinových agregátů tau. Vývoj důvěryhodných modelů tauopatie in vitro je proto zásadní pro další základní a farmakologický výzkum. V práci byly porovnány podmínky kultivace neuroblastomové buněčné linie a byla prozkoumána možnost provádění testů tau výsevu ve dvojrozměrné a trojrozměrné buněčné kultuře. Ukázalo se, že SH-SY5Y diferencované pomocí RA a BDNF jsou vhodné pro výzkum třídění TAU a výsevu R3 agregátů. Diferencované buňky také vykazovaly významné zvýšení produkce cholin acetyltransferázy, což naznačuje směr jejich vývoje ve prospěch cholinergních neuronů.
Buněčná linie napodobující astrocyty (SNB-75) byla vybrána kvůli expresi gliálního fibrilárního kyselého proteinu. Bylo prokázáno, že ji můžeme kultivovat současně s SH-SY5Y. Byl rovněž stanoven protokol pro jejich diferenciaci ve společné kultuře. Buňky SNB-75 prokázaly schopnost ovlivňovat výsev tau. Aktivita výsevu v monokultuře a v kokultuře byla pozorována pomocí fluorescenční mikroskopie. Diferenciace byla kontrolována morfologickou analýzou a western blottingem. Buněčné linie se vyznačují relativně nízkými náklady na kultivaci, snadnou genetickou modifikací, možností diferenciace a tvorby sféroidů. Mohou být zajímavé jako základ pro vytvoření trojrozměrného modelu společné kultivace buněk s vlastnostmi astrocytů a neuronů, který může odrážet podmínky počátečního stadia tauopatie s minimem vynaložených časových a finančních prostředků.
Anotace v angličtině
Due to the growing number of patients with various forms of dementia associated with tau pathologies, choosing a reliable model for studying the mechanisms of tau sorting, seeding and the formation of pathological protein aggregates is essential. Therefore, developing trustworthy tauopathy in vitro models is crucial for further fundamental and pharmacological research. The conditions for cultivating the neuroblastoma cell line were compared in the thesis, and the possibility of performing the tau seeding assays in two-dimensional and three-dimensional versions was explored. It was shown that SH-SY5Y differentiated with RA and BDNF are suitable for research of TAU sorting and seeding with R3 aggregates. Differentiated cells also showed a significant increase in the production of Choline Acetyltransferase, which indicates the direction of their development in favor of cholinergic neurons.
A cell line miming astrocytes (SNB-75) was chosen due to the expression of the glial fibrillary acidic protein. It can be cultured simultaneously with SH-SY5Y. The protocol for their differentiation in co-culture was also established. SNB-75 cells demonstrated the ability to influence tau seeding. The seeding activities in mono- and co-cultures were observed using fluorescent microscopy. The differentiation was controlled by morphology analysis and western blotting. The cell lines are characterized by a comparatively low cost of cultivation, the ease of genetic modification, the possibility of differentiation and the formation of spheroids. They may be of interest as a basis for creating a three-dimensional model of the co-culture of cells with the properties of astrocytes and neurons, which can reflect the conditions for the initial stage of tauopathy with a minimum of time and financial resources spent.
Klíčová slova
Tau agregáty, Alzheimerova choroba, sféroidy, tauopatie, tau seeding
Klíčová slova v angličtině
Tau aggregates, Alzheimer's disease, spheroids, tauopathy, tau seeding
Rozsah průvodní práce
67s.
Jazyk
AN
Anotace
Vzhledem k rostoucímu počtu pacientů s různými formami demence spojenými s patologií tau je zásadní zvolit spolehlivý model pro studium mechanismů třídění, výsevu a tvorby patologických proteinových agregátů tau. Vývoj důvěryhodných modelů tauopatie in vitro je proto zásadní pro další základní a farmakologický výzkum. V práci byly porovnány podmínky kultivace neuroblastomové buněčné linie a byla prozkoumána možnost provádění testů tau výsevu ve dvojrozměrné a trojrozměrné buněčné kultuře. Ukázalo se, že SH-SY5Y diferencované pomocí RA a BDNF jsou vhodné pro výzkum třídění TAU a výsevu R3 agregátů. Diferencované buňky také vykazovaly významné zvýšení produkce cholin acetyltransferázy, což naznačuje směr jejich vývoje ve prospěch cholinergních neuronů.
Buněčná linie napodobující astrocyty (SNB-75) byla vybrána kvůli expresi gliálního fibrilárního kyselého proteinu. Bylo prokázáno, že ji můžeme kultivovat současně s SH-SY5Y. Byl rovněž stanoven protokol pro jejich diferenciaci ve společné kultuře. Buňky SNB-75 prokázaly schopnost ovlivňovat výsev tau. Aktivita výsevu v monokultuře a v kokultuře byla pozorována pomocí fluorescenční mikroskopie. Diferenciace byla kontrolována morfologickou analýzou a western blottingem. Buněčné linie se vyznačují relativně nízkými náklady na kultivaci, snadnou genetickou modifikací, možností diferenciace a tvorby sféroidů. Mohou být zajímavé jako základ pro vytvoření trojrozměrného modelu společné kultivace buněk s vlastnostmi astrocytů a neuronů, který může odrážet podmínky počátečního stadia tauopatie s minimem vynaložených časových a finančních prostředků.
Anotace v angličtině
Due to the growing number of patients with various forms of dementia associated with tau pathologies, choosing a reliable model for studying the mechanisms of tau sorting, seeding and the formation of pathological protein aggregates is essential. Therefore, developing trustworthy tauopathy in vitro models is crucial for further fundamental and pharmacological research. The conditions for cultivating the neuroblastoma cell line were compared in the thesis, and the possibility of performing the tau seeding assays in two-dimensional and three-dimensional versions was explored. It was shown that SH-SY5Y differentiated with RA and BDNF are suitable for research of TAU sorting and seeding with R3 aggregates. Differentiated cells also showed a significant increase in the production of Choline Acetyltransferase, which indicates the direction of their development in favor of cholinergic neurons.
A cell line miming astrocytes (SNB-75) was chosen due to the expression of the glial fibrillary acidic protein. It can be cultured simultaneously with SH-SY5Y. The protocol for their differentiation in co-culture was also established. SNB-75 cells demonstrated the ability to influence tau seeding. The seeding activities in mono- and co-cultures were observed using fluorescent microscopy. The differentiation was controlled by morphology analysis and western blotting. The cell lines are characterized by a comparatively low cost of cultivation, the ease of genetic modification, the possibility of differentiation and the formation of spheroids. They may be of interest as a basis for creating a three-dimensional model of the co-culture of cells with the properties of astrocytes and neurons, which can reflect the conditions for the initial stage of tauopathy with a minimum of time and financial resources spent.
Klíčová slova
Tau agregáty, Alzheimerova choroba, sféroidy, tauopatie, tau seeding
Klíčová slova v angličtině
Tau aggregates, Alzheimer's disease, spheroids, tauopathy, tau seeding
Zásady pro vypracování
Vědecký význam:
Vzhledem k nárůstu počtu lidí trpících nemocemi souvisejícími se stárnutím, které se vyznačují akumulací intracytoplazmatických agregátů proteinu tau, roste význam vytváření buněčných modelů pro studium mechanismů vývoje patologických procesů a testování léků. Tau výsev je charakteristický fenomén, který začíná dlouho před rozvojem atrofie šedé hmoty v mozcích pacientů s diagnostikovanými tauopatiemi, jako je Alzheimerova choroba, frontotemporální demence, progresivní supranukleární obrna a kortikobazální degenerace. Analýza literatury ukázala, že tradiční buněčné modely poskytují nejisté výsledky, protože podmínky pro kultivaci buněk v těchto systémech odporují fyziologickým podmínkám. Složitost interakcí mezi neurony, gliovými buňkami, astrocyty a dalšími mozkovými buňkami v živém organismu je nepopiratelná. Tato práce je orientována na vývoj 3D kultur neuronových a neneuronových buněčných linií, aby lépe napodobovaly fyziologii mozku v misce, a na studium mechanismu tau výsevu ve vyvinutém 3D kultivačním systému.
Zásady pro vypracování
Vědecký význam:
Vzhledem k nárůstu počtu lidí trpících nemocemi souvisejícími se stárnutím, které se vyznačují akumulací intracytoplazmatických agregátů proteinu tau, roste význam vytváření buněčných modelů pro studium mechanismů vývoje patologických procesů a testování léků. Tau výsev je charakteristický fenomén, který začíná dlouho před rozvojem atrofie šedé hmoty v mozcích pacientů s diagnostikovanými tauopatiemi, jako je Alzheimerova choroba, frontotemporální demence, progresivní supranukleární obrna a kortikobazální degenerace. Analýza literatury ukázala, že tradiční buněčné modely poskytují nejisté výsledky, protože podmínky pro kultivaci buněk v těchto systémech odporují fyziologickým podmínkám. Složitost interakcí mezi neurony, gliovými buňkami, astrocyty a dalšími mozkovými buňkami v živém organismu je nepopiratelná. Tato práce je orientována na vývoj 3D kultur neuronových a neneuronových buněčných linií, aby lépe napodobovaly fyziologii mozku v misce, a na studium mechanismu tau výsevu ve vyvinutém 3D kultivačním systému.
Seznam doporučené literatury
1. Narendran Annadurai, Juan B. De Sanctis, Marian Hajdúch, Viswanath Das. Tau secretion and propagation: Perspectives for potential preventive interventions in Alzheimer's disease and other tauopathies. Experimental Neurology, 343; 113756 (2021).
2. Narendran Annadurai, Lukáš Malina, Mario Salmona, Luisa Diomede, Antonio Bastone, Alfredo Cagnotto, Margherita Romeo, Martin Šrejber, Karel Berka, Michal Otyepka, Marián Hajdúch, Viswanath Das. Antitumour drugs targeting Tau R3 VQIVYK and Cys322 Prevent Seeding of endogenous Tau aggregates by Exogenous Seeds. The FEBS Journal, 2021. doi: 10.1111/FEBS.16270
3. Diana Seidel, Dana Krinke, Heinz-Georg Jahnke, Anika Hirche, Daniel Kloß, Till G A Mack, Frank Striggow, Andrea Robitzki. Induced Tauopathy in a Novel 3D-Culture Model Mediates Neurodegenerative Processes: A Real-Time Study on Biochips. PLOS ONE, 7: e49150 (2012).
4. Ilaria Raimondi, Marta Tunesi, Gianluigi Forl, Diego Albani and Carmen Giordano.3D brain tissue physiological model with co-cultured primary neurons and glial cells in hydrogels. Journal of Tissue Engineering, 11: 1-3 (2020).
5. Ye Peng, Shifeng Chu, Yantao Yang, Zhao Zhang, Zongran Pang, Naihong Chen. Neuroinflammatory In Vitro Cell Culture Models and the Potential Applications for Neurological Disorders. Frontiers in Pharmacology, 12: 671734 (2021).
6. Samantha N. Lanjewar and Steven A. Sloan. Growing Glia: Cultivating Human Stem Cell Models of Gliogenesis in Health and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9: 649538 (2021).
7. Branden Stansley, Jan Post and Kenneth Hensley. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation, 9:115 (2012).
8. Tarun N. Bhatia, Deepti B. Pant, Elizabeth A. Eckhoff, Rachel N. Gongaware, Timothy Do, Daniel F. Hutchison, Amanda M. Gleixner and Rehana K. Leak. Astrocytes Do Not Forfeit Their Neuroprotective Roles After Surviving Intense Oxidative Stress. Frontier in Molecular Neuroscience, 12: 87 (2019).
Seznam doporučené literatury
1. Narendran Annadurai, Juan B. De Sanctis, Marian Hajdúch, Viswanath Das. Tau secretion and propagation: Perspectives for potential preventive interventions in Alzheimer's disease and other tauopathies. Experimental Neurology, 343; 113756 (2021).
2. Narendran Annadurai, Lukáš Malina, Mario Salmona, Luisa Diomede, Antonio Bastone, Alfredo Cagnotto, Margherita Romeo, Martin Šrejber, Karel Berka, Michal Otyepka, Marián Hajdúch, Viswanath Das. Antitumour drugs targeting Tau R3 VQIVYK and Cys322 Prevent Seeding of endogenous Tau aggregates by Exogenous Seeds. The FEBS Journal, 2021. doi: 10.1111/FEBS.16270
3. Diana Seidel, Dana Krinke, Heinz-Georg Jahnke, Anika Hirche, Daniel Kloß, Till G A Mack, Frank Striggow, Andrea Robitzki. Induced Tauopathy in a Novel 3D-Culture Model Mediates Neurodegenerative Processes: A Real-Time Study on Biochips. PLOS ONE, 7: e49150 (2012).
4. Ilaria Raimondi, Marta Tunesi, Gianluigi Forl, Diego Albani and Carmen Giordano.3D brain tissue physiological model with co-cultured primary neurons and glial cells in hydrogels. Journal of Tissue Engineering, 11: 1-3 (2020).
5. Ye Peng, Shifeng Chu, Yantao Yang, Zhao Zhang, Zongran Pang, Naihong Chen. Neuroinflammatory In Vitro Cell Culture Models and the Potential Applications for Neurological Disorders. Frontiers in Pharmacology, 12: 671734 (2021).
6. Samantha N. Lanjewar and Steven A. Sloan. Growing Glia: Cultivating Human Stem Cell Models of Gliogenesis in Health and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9: 649538 (2021).
7. Branden Stansley, Jan Post and Kenneth Hensley. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation, 9:115 (2012).
8. Tarun N. Bhatia, Deepti B. Pant, Elizabeth A. Eckhoff, Rachel N. Gongaware, Timothy Do, Daniel F. Hutchison, Amanda M. Gleixner and Rehana K. Leak. Astrocytes Do Not Forfeit Their Neuroprotective Roles After Surviving Intense Oxidative Stress. Frontier in Molecular Neuroscience, 12: 87 (2019).