Abstrakt
Vitamíny rozpustné v tucích jsou kritické mikronutrienty pro živočichy včetně lidí. Existují čtyři hlavní skupiny vitamínů rozpustných v tucích: A, D, E a K. Vzhledem k charakteristikám vitamínů rozpustných v tucích je důležité stanovit jejich koncentrace v organismu. Avšak je obtížné stanovit všechny v jedné analýze. Pro tuto studii byly vybrány hlavní formy každé skupiny vitamínů: retinol, alfa tokoferol, cholekalciferol, kalcidiol a fylochinon. Cíle práce se zaměřovaly na získání potřebných informací k vývoji a metody na analýzu vitamínů rozpustných v tucích a jejich následnou validaci.
Vývoj metody začal s extrakcí pomocí methanolu, elucí LC gradientu využívá mobilní fáze: (A) Methanol/voda (50/50, v/v) + 0.2% kyselina mravenčí a (B) methanol + 0.2% kyselina mravenčí a detekcí pomocí hmotnostního spektrometru s analýzou pomocí orbitální pasti. Jednofázová extrakce však nebyla dostatečně účinná, přistoupilo se tedy k dvoufázové extrakci pomocí směsi hexanu a chloroformu (90/10, v/v), která byla efektivnější. Avšak analýza orbitální pastí nebyla dostatečně senzitivní pro detekci všech vybraných vitamínů rozpustných v tucích, tedy byla MS detekce přesunuta na kvadrupólový hmotnostní spektrometr s použitím "Multiple reaction monitoring (MRM)". Příprava vzorku byla optimalizovaná. Finální metoda byla validovaná pro vitamíny A a E pomocí norem evropské medicínské agentury. (EMA)
Anotace v angličtině
Fat-soluble vitamins (FSVs) are crucial micronutrients for animals, including humans. Four main FSVs groups exist: A, D, E and K. Due to the nature of FSVs, it is essential to determine the concentrations in the organism, but at the same time, it is challenging to analyse all of the FSVs in one analysis. For this study, only the main forms of each FSV were selected: retinol, alpha-tocopherol, cholecalciferol, calcidiol and phylloquinone. The aims of the work were focused on obtaining the necessary background for the development of the assay analysing FSVs and their following validation.
The assay development started with the extraction using methanol and LC gradient elution applying mobile phases (A) Methanol/water (50/50, v/v) + 0.2% formic acid and (B) methanol + 0.2% formic acid with detection on orbitrap mass spectrometer. The monophasic extraction was not efficient enough. Therefore, biphasic extraction was introduced using a mixture of hexane and chloroform (90/10, v/v), which was the most effective. However, the orbitrap was not sensitive enough to detect all selected FSVs; thus, the MS detection was switched to triple quadrupole (QQQ), applying multiple reaction monitoring (MRM). The sample preparation was modified to obtain better results. The final assay for vitamins A and E was validated according to the European medical agency (EMA) guidelines.
Abstrakt
Vitamíny rozpustné v tucích jsou kritické mikronutrienty pro živočichy včetně lidí. Existují čtyři hlavní skupiny vitamínů rozpustných v tucích: A, D, E a K. Vzhledem k charakteristikám vitamínů rozpustných v tucích je důležité stanovit jejich koncentrace v organismu. Avšak je obtížné stanovit všechny v jedné analýze. Pro tuto studii byly vybrány hlavní formy každé skupiny vitamínů: retinol, alfa tokoferol, cholekalciferol, kalcidiol a fylochinon. Cíle práce se zaměřovaly na získání potřebných informací k vývoji a metody na analýzu vitamínů rozpustných v tucích a jejich následnou validaci.
Vývoj metody začal s extrakcí pomocí methanolu, elucí LC gradientu využívá mobilní fáze: (A) Methanol/voda (50/50, v/v) + 0.2% kyselina mravenčí a (B) methanol + 0.2% kyselina mravenčí a detekcí pomocí hmotnostního spektrometru s analýzou pomocí orbitální pasti. Jednofázová extrakce však nebyla dostatečně účinná, přistoupilo se tedy k dvoufázové extrakci pomocí směsi hexanu a chloroformu (90/10, v/v), která byla efektivnější. Avšak analýza orbitální pastí nebyla dostatečně senzitivní pro detekci všech vybraných vitamínů rozpustných v tucích, tedy byla MS detekce přesunuta na kvadrupólový hmotnostní spektrometr s použitím "Multiple reaction monitoring (MRM)". Příprava vzorku byla optimalizovaná. Finální metoda byla validovaná pro vitamíny A a E pomocí norem evropské medicínské agentury. (EMA)
Anotace v angličtině
Fat-soluble vitamins (FSVs) are crucial micronutrients for animals, including humans. Four main FSVs groups exist: A, D, E and K. Due to the nature of FSVs, it is essential to determine the concentrations in the organism, but at the same time, it is challenging to analyse all of the FSVs in one analysis. For this study, only the main forms of each FSV were selected: retinol, alpha-tocopherol, cholecalciferol, calcidiol and phylloquinone. The aims of the work were focused on obtaining the necessary background for the development of the assay analysing FSVs and their following validation.
The assay development started with the extraction using methanol and LC gradient elution applying mobile phases (A) Methanol/water (50/50, v/v) + 0.2% formic acid and (B) methanol + 0.2% formic acid with detection on orbitrap mass spectrometer. The monophasic extraction was not efficient enough. Therefore, biphasic extraction was introduced using a mixture of hexane and chloroform (90/10, v/v), which was the most effective. However, the orbitrap was not sensitive enough to detect all selected FSVs; thus, the MS detection was switched to triple quadrupole (QQQ), applying multiple reaction monitoring (MRM). The sample preparation was modified to obtain better results. The final assay for vitamins A and E was validated according to the European medical agency (EMA) guidelines.
Osvojit si principy chromatografie a hmotnostní spektrometrie
Seznámit se s vitamíny rozpustnými v tucích a s problematikou metabolomiky.
Seznámit se s obecnými principy validace a vyhláškami s tím spojenými.
Validovat LC-MS metodu vyvinutou pro analýzu vitamínů rozpustných v tucích.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Osvojit si principy chromatografie a hmotnostní spektrometrie
Seznámit se s vitamíny rozpustnými v tucích a s problematikou metabolomiky.
Seznámit se s obecnými principy validace a vyhláškami s tím spojenými.
Validovat LC-MS metodu vyvinutou pro analýzu vitamínů rozpustných v tucích.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
BIoANALYTICAL METHOD VALIDATION M10. (n.d.).
dop-validace. (n.d.). Fda, & Cder. (2018).
Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Biopharmaceutics Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Biopharmaceutics Contains Nonbinding Recommendations.
http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htmand/or
http://www.fda.gov/AnimalVeterinary/GuidanceComplianceEnforcement/GuidanceforIndustry/default.htm
Ocke,’, M. C., Schrijver, J., Obermann-De Boer, G. L., Bloemberg,’, B. P. M., Haenen’, G. R. M. M., & Kromhout3, D. (1995). STABILITY OF BLOOD (PRO)VITAMINS DURING FOUR YEARS OF STORAGE AT-20°C: CONSEQUENCES FOR EPIDEMIOLOGIC RESEARCH. In J Clin Epidemiol (Vol. 48, Issue 8). Keevil, B. G. (2011).
The analysis of dried blood spot samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry. In Clinical Biochemistry (Vol. 44, Issue 1, pp. 110–118). https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2010.06.014
Verstraete, J., Boffel, L., & Stove, C. (2020). Dried blood microsample-assisted determination of vitamins: Recent developments and challenges. In TrAC - Trends in Analytical Chemistry (Vol. 132). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.trac.2020.116057
Huang, Y., Clements, P. R., & Gibson, R. A. (2015). Robust measurement of vitamin A status in plasma and blood dried on paper. Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 102–103, 31–36. https://doi.org/10.1016/j.plefa.2015.10.001
Seznam doporučené literatury
BIoANALYTICAL METHOD VALIDATION M10. (n.d.).
dop-validace. (n.d.). Fda, & Cder. (2018).
Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Biopharmaceutics Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry Biopharmaceutics Contains Nonbinding Recommendations.
http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htmand/or
http://www.fda.gov/AnimalVeterinary/GuidanceComplianceEnforcement/GuidanceforIndustry/default.htm
Ocke,’, M. C., Schrijver, J., Obermann-De Boer, G. L., Bloemberg,’, B. P. M., Haenen’, G. R. M. M., & Kromhout3, D. (1995). STABILITY OF BLOOD (PRO)VITAMINS DURING FOUR YEARS OF STORAGE AT-20°C: CONSEQUENCES FOR EPIDEMIOLOGIC RESEARCH. In J Clin Epidemiol (Vol. 48, Issue 8). Keevil, B. G. (2011).
The analysis of dried blood spot samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry. In Clinical Biochemistry (Vol. 44, Issue 1, pp. 110–118). https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2010.06.014
Verstraete, J., Boffel, L., & Stove, C. (2020). Dried blood microsample-assisted determination of vitamins: Recent developments and challenges. In TrAC - Trends in Analytical Chemistry (Vol. 132). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.trac.2020.116057
Huang, Y., Clements, P. R., & Gibson, R. A. (2015). Robust measurement of vitamin A status in plasma and blood dried on paper. Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 102–103, 31–36. https://doi.org/10.1016/j.plefa.2015.10.001
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Vývoj a validace LC-MS metody pro analýzu vitamínů rozpustných v tucích studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Danihlík: Jaké extrakční postupy využili autoři citované literatury? Dalo by se na těchto metodách stavět?
prof. Petřivalský: Jak si vysvětlíte posilující efekt matrice u některých analytů?
dr. Janků: Dalo by se vyhodnotit, jaký typ vzorku byl lepší pro analýzu těchto vitamínů?