Diplomová práca sa zaoberá vývojom metódy pre stanovenie fosfatidylethanolu v ľudskej krvi technikou LC/MS. Fosfatidylethanol vzniká z fosfatidylcholínu v krvi len za prítomnosti ethanolu, čo ho robí sľubným biomarkerom konzumácie alkoholu, použiteľným v klinickej a forenznej praxi. Boli vyvinuté dve metódy stanovenia PEth v krvi, jedna pre roztoky štandardov a druhá bola optimalizovaná pre reálne vzorky, kedy interferenty eluujúce sa v blízkosti retenčných časov analytu a vnútorného štandardu PProp si vynútili predĺženie doby analýzy. Tieto interferenty boli následne predbežne identifikované na základe fragmentačných spektier a databázy lipidov Lipid Maps, avšak sa už nepodarilo identifikovať presnú izomériu. PEth bol vyvinutou metódou stanovený v modelových (spikovaných) vzorkách plnej krvi.
Anotace v angličtině
The diploma thesis deals with the development of a method for determination of phosphatidylethanol in human blood by LC/MS. Phosphatidylethanol is formed from phosphatidylcholine in blood only in the presence of ethanol, making it a promising biomarker of alcohol consumption that can be used in clinical practice for PEth screening. Two methods have been developed to determine phosphatidylethanol in blood, one for standards and the other was optimized for real samples, when interferents eluting near the retention times of the analyte and internal standard phosphatidylpropanol forced an extension of the analysis time. These interferents were subsequently tentatively identified using collision-induced dissociation spectra and the Lipid Maps database, without exact isomerism identification. Using the developed method, PEth was quantified in model (spiked) samples of whole blood.
Phosphatidylethanol, biomarker of alcoholism, human blood, liquid chromatography, mass spectrometry, method development, sample preparation
Rozsah průvodní práce
54
Jazyk
SK
Anotace
Diplomová práca sa zaoberá vývojom metódy pre stanovenie fosfatidylethanolu v ľudskej krvi technikou LC/MS. Fosfatidylethanol vzniká z fosfatidylcholínu v krvi len za prítomnosti ethanolu, čo ho robí sľubným biomarkerom konzumácie alkoholu, použiteľným v klinickej a forenznej praxi. Boli vyvinuté dve metódy stanovenia PEth v krvi, jedna pre roztoky štandardov a druhá bola optimalizovaná pre reálne vzorky, kedy interferenty eluujúce sa v blízkosti retenčných časov analytu a vnútorného štandardu PProp si vynútili predĺženie doby analýzy. Tieto interferenty boli následne predbežne identifikované na základe fragmentačných spektier a databázy lipidov Lipid Maps, avšak sa už nepodarilo identifikovať presnú izomériu. PEth bol vyvinutou metódou stanovený v modelových (spikovaných) vzorkách plnej krvi.
Anotace v angličtině
The diploma thesis deals with the development of a method for determination of phosphatidylethanol in human blood by LC/MS. Phosphatidylethanol is formed from phosphatidylcholine in blood only in the presence of ethanol, making it a promising biomarker of alcohol consumption that can be used in clinical practice for PEth screening. Two methods have been developed to determine phosphatidylethanol in blood, one for standards and the other was optimized for real samples, when interferents eluting near the retention times of the analyte and internal standard phosphatidylpropanol forced an extension of the analysis time. These interferents were subsequently tentatively identified using collision-induced dissociation spectra and the Lipid Maps database, without exact isomerism identification. Using the developed method, PEth was quantified in model (spiked) samples of whole blood.
Phosphatidylethanol, biomarker of alcoholism, human blood, liquid chromatography, mass spectrometry, method development, sample preparation
Zásady pro vypracování
1) Provedení literární rešerše zaměřené na recentní metody stanovení fosfatidylethanolu v krvi. Zpracování teoretické části diplomové práce.
2) Vývoj metody pro separaci standardů fosfatidylethanolu kapalinovou chromatografií s hmotnostně spektrometrickou detekcí.
3) Optimalizace přípravy vzorku plné krve s cílem dosažení dostatečné výtěžnosti pro analyty za současného odstranění interferujících látek.
4) Aplikace vyvinuté metody na reálné vzorky biologického materiálu (tj. krve).
3) Vypracování textu experimentální části diplomové práce, diskuze výsledků.
Zásady pro vypracování
1) Provedení literární rešerše zaměřené na recentní metody stanovení fosfatidylethanolu v krvi. Zpracování teoretické části diplomové práce.
2) Vývoj metody pro separaci standardů fosfatidylethanolu kapalinovou chromatografií s hmotnostně spektrometrickou detekcí.
3) Optimalizace přípravy vzorku plné krve s cílem dosažení dostatečné výtěžnosti pro analyty za současného odstranění interferujících látek.
4) Aplikace vyvinuté metody na reálné vzorky biologického materiálu (tj. krve).
3) Vypracování textu experimentální části diplomové práce, diskuze výsledků.
Seznam doporučené literatury
1) A. Isaksson a kol., High-Throughput LC-MS/MS Method for Determination of the Alcohol Use Biomarker Phosphatidylethanol in Clinical Samples by Use of a Simple Automated Extraction Procedure - Preanalytical and Analytical Conditions, The Journal of Applied Laboratory Medicine 2 (2018) 880 - 892
2) B. Jørgenrud a kol., Determination of the alcohol biomarker phosphatidylethanol 16:0/18:1 and 33 compounds from eight different drug classes in whole blood by LC-MS/MS. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 107 (2021) 106939
3) H. Lakso a kol., Long-term stability of the alcohol consumption biomarker phosphatidylethanol in erythrocytes at −80 °C. Clin. Mass Spectrom. 11 (2019) 37 - 41
4) Casati, S. a kol., An automated sample preparation approach for routine liquid chromatography tandem-mass spectrometry measurement of the alcohol biomarkers phosphatidylethanol 16:0/18:1, 16:0/16:0 and 18:1/18:1. J. Chromatogr. A 1589 (2019) 1 - 9
5) H. Gnann a kol., Identification of 48 homologues of phosphatidylethanol in blood by LC-ESI-MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry 396 (2010) 2415 - 2423
6) Nguyen, V. L., Paull, P., Haber, P. S., Chitty, K. & Seth, D. Evaluation of a novel method for the analysis of alcohol biomarkers: Ethyl glucuronide, ethyl sulfate and phosphatidylethanol. Alcohol 67 (2018) 7 - 13
7) D. Oppolzer a kol., Bioanalytical procedures and developments in the determination of alcohol biomarkers in biological specimens. Bioanalysis 8 (2016) 229 - 51
8) A. Nalesso a kol., Quantitative profiling of phosphatidylethanol molecular species in human blood by liquid chromatography high resolution mass spektrometry. Journal of Chromatography A 1218 (2011) 8423 – 8431
9) Další literatura na dané téma dostupná prostřednictvím knihoven a dle vyhledávání v databázích SciFinder / Web of Science / Scopus.
Seznam doporučené literatury
1) A. Isaksson a kol., High-Throughput LC-MS/MS Method for Determination of the Alcohol Use Biomarker Phosphatidylethanol in Clinical Samples by Use of a Simple Automated Extraction Procedure - Preanalytical and Analytical Conditions, The Journal of Applied Laboratory Medicine 2 (2018) 880 - 892
2) B. Jørgenrud a kol., Determination of the alcohol biomarker phosphatidylethanol 16:0/18:1 and 33 compounds from eight different drug classes in whole blood by LC-MS/MS. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 107 (2021) 106939
3) H. Lakso a kol., Long-term stability of the alcohol consumption biomarker phosphatidylethanol in erythrocytes at −80 °C. Clin. Mass Spectrom. 11 (2019) 37 - 41
4) Casati, S. a kol., An automated sample preparation approach for routine liquid chromatography tandem-mass spectrometry measurement of the alcohol biomarkers phosphatidylethanol 16:0/18:1, 16:0/16:0 and 18:1/18:1. J. Chromatogr. A 1589 (2019) 1 - 9
5) H. Gnann a kol., Identification of 48 homologues of phosphatidylethanol in blood by LC-ESI-MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry 396 (2010) 2415 - 2423
6) Nguyen, V. L., Paull, P., Haber, P. S., Chitty, K. & Seth, D. Evaluation of a novel method for the analysis of alcohol biomarkers: Ethyl glucuronide, ethyl sulfate and phosphatidylethanol. Alcohol 67 (2018) 7 - 13
7) D. Oppolzer a kol., Bioanalytical procedures and developments in the determination of alcohol biomarkers in biological specimens. Bioanalysis 8 (2016) 229 - 51
8) A. Nalesso a kol., Quantitative profiling of phosphatidylethanol molecular species in human blood by liquid chromatography high resolution mass spektrometry. Journal of Chromatography A 1218 (2011) 8423 – 8431
9) Další literatura na dané téma dostupná prostřednictvím knihoven a dle vyhledávání v databázích SciFinder / Web of Science / Scopus.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Studentka představila komisi svou diplomovou práci na téma Stanovenie fosfatidylethanolu v krvi technikou kvapalinovej chromatografie s hmotnostne spektrometrickou detekciou. Na úvod přítomné seznámila s globální problematikou alkoholismu, se kterým souvisí stanovovaná látka. Představila studovanou látku a cíle práce. Prezentovala parametry analýzy a význam vybraných obsahů sledované látky ve vzorku krve. Popsala postup přípravy reálných vzorků. Představila a diskutovala získané výsledky, včetně získané kalibrační závislosti a z ní vypočítaných statistických parametrů. Závěrem popsala některé identifikované složky matrice.
Vedoucí práce shrnul obsah práce. Ocenil kvalitní grafickou a jazykovou úroveň práce. Za určitou slabinu považuje méně propracovanou problematiku interferujících a koeluujících látek, ovšem zmínil, že tento aspekt je velice rozsáhlý a detailnější popis nebyl z časových důvodů možný. V rámci diskuze položil následující dotaz: Z analýzy modelových vzorků krve je zřejmé, že biologická matrice obsahuje řadu potenciálně interferujících látek i v případě použití tandemové hmotnostní detekce. Jakými modifikacemi instrumentálních technik by se dal vliv interferujících látek potlačit, jednak na úrovni chromatografické separace a jednak na úrovni hmotnostní detekce?. Studentka na dotaz uspokojivě odpověděla. Vedoucí práci doporučil k obhajobě.
Oponent stručně popsal obsah práce. Ocenil kvalitní a srozumitelné zpracování práce. Během diskuze položil studentce tyto dotazy: Do akej miery je korektné používanie neurotransmiterov (dopamínu, serotonínu, GABA atd.) ako markerov charakteristiky u predikcie alkoholizmu? Či by sa k analýze fosfatidyletanolu nedali využiť elektromigračné metódy? Kto a do čoho odoberal krv volontérky? Prečo sa pre analýzu zvolila teplota systému 40 °C? Čím si vysvetľuje posun retenčných časov cieľových analytov v rôznych dňoch nástreku (str.41)? Či pri vývoji metódy venovala pozornosť i prácam prof. Holčapka? Ako dopadli namerané LOD a LOQ v porovnaní s výsledkami prác Andersa Helandera a ako si Anders Helander poradil (eliminoval) so spomínanými 12 interferujúcimi glycerolfosfolipidmi? Studentka na všechny položené otázky uspokojivě odpověděla. Oponent práci doporučil k obhajobě.
Při veřejné diskuzi byl položen následující dotaz: Co Vás vedlo k volbě nižší hladiny při ověřování preciznosti?