Tiotropium bromid je bronchodilatans užívané jako léčivo nemocí spojených s obstrukcí dýchacích cest jako je astma nebo chronická obstrukční plicní nemoc. Je to selektivní, kompetitivní, reverzibilní antagonista muskarinových receptorů s ultra-dlouhodobým účinkem. Při podání tiotropia nedochází k výrazné biotransformaci a velká část tiotropia je vyloučena v nezměněné formě.
Cílem práce bylo zavedení LC/MS metody pro stanovení tiotropia v biologických vzorcích, konkrétně v moči. Práce obsahuje literární rešerši na téma tiotropium, HPLC, hmotnostní spektrometrie a validace. Experimentální část popisuje volbu podmínek analýzy, přípravu vzorku, kalibraci a validaci metody. Následně byly změřeny biologické vzorky od jednoho pacienta.
Srážení acetonitrilem a následná SPE extrakce pomocí SCX kolonek byla zvolena jako nejlepší úprava vzorku. Pro HPLC analýzu byla použita kolona Luna SCX (150 × 3 mm, s částicemi 5 ?m) a separace probíhala isokraticky. Jako mobilní fáze byl použit 30mM mravenčan amonný s pH 4 ve směsi s acetonitrilem v poměru 20:80.
Zavedená metoda splňuje parametry validace a umožňuje tak spolehlivě stanovit koncentraci tiotropia v moči u pacientů.
Anotace v angličtině
Tiotropium bromide is a bronchodilator used as a drug to treat of diseases associated with airway obstruction like asthma or chronic obstructive pulmonary disease. It is the selective, competitive, reversible muscarinic receptor antagonist with ultra-long-lasting effect. Administered tiotropium is not significantly biotransformed and a large portion is eliminated in unchanged form.
The aim of the thesis was to develop the LC/MS method for tiotropium determination in biological samples, specifically in urine. The thesis contains a review on topics of tiotropium, HPLC, mass spectrometry, and validation. Experimental part describes the choice of analysis conditions, sample preparation, calibration, and validation of the method. Subsequently, biological samples from one patient were measured.
For sample preparation, acetonitrile precipitation followed by SPE extraction on SCX columns was chosen as the best. For HPLC analysis, the Luna SCX column (150 × 3 mm, with 5 ?m particles) was used and the separation was isocratic. The solution of 30mM ammonium formate with pH of 4 mixed with acetonitrile in a ratio 20:80 was used as the mobile phase.
The established method meets the validation parameters and thus enables reliable determination of the concentration of tiotropium in the urine of patients.
Tiotropium, HPLC, mass spectrometry, tandem mass spectrometry, urine, validation
Rozsah průvodní práce
57 s.
Jazyk
CZ
Anotace
Tiotropium bromid je bronchodilatans užívané jako léčivo nemocí spojených s obstrukcí dýchacích cest jako je astma nebo chronická obstrukční plicní nemoc. Je to selektivní, kompetitivní, reverzibilní antagonista muskarinových receptorů s ultra-dlouhodobým účinkem. Při podání tiotropia nedochází k výrazné biotransformaci a velká část tiotropia je vyloučena v nezměněné formě.
Cílem práce bylo zavedení LC/MS metody pro stanovení tiotropia v biologických vzorcích, konkrétně v moči. Práce obsahuje literární rešerši na téma tiotropium, HPLC, hmotnostní spektrometrie a validace. Experimentální část popisuje volbu podmínek analýzy, přípravu vzorku, kalibraci a validaci metody. Následně byly změřeny biologické vzorky od jednoho pacienta.
Srážení acetonitrilem a následná SPE extrakce pomocí SCX kolonek byla zvolena jako nejlepší úprava vzorku. Pro HPLC analýzu byla použita kolona Luna SCX (150 × 3 mm, s částicemi 5 ?m) a separace probíhala isokraticky. Jako mobilní fáze byl použit 30mM mravenčan amonný s pH 4 ve směsi s acetonitrilem v poměru 20:80.
Zavedená metoda splňuje parametry validace a umožňuje tak spolehlivě stanovit koncentraci tiotropia v moči u pacientů.
Anotace v angličtině
Tiotropium bromide is a bronchodilator used as a drug to treat of diseases associated with airway obstruction like asthma or chronic obstructive pulmonary disease. It is the selective, competitive, reversible muscarinic receptor antagonist with ultra-long-lasting effect. Administered tiotropium is not significantly biotransformed and a large portion is eliminated in unchanged form.
The aim of the thesis was to develop the LC/MS method for tiotropium determination in biological samples, specifically in urine. The thesis contains a review on topics of tiotropium, HPLC, mass spectrometry, and validation. Experimental part describes the choice of analysis conditions, sample preparation, calibration, and validation of the method. Subsequently, biological samples from one patient were measured.
For sample preparation, acetonitrile precipitation followed by SPE extraction on SCX columns was chosen as the best. For HPLC analysis, the Luna SCX column (150 × 3 mm, with 5 ?m particles) was used and the separation was isocratic. The solution of 30mM ammonium formate with pH of 4 mixed with acetonitrile in a ratio 20:80 was used as the mobile phase.
The established method meets the validation parameters and thus enables reliable determination of the concentration of tiotropium in the urine of patients.
Tiotropium, HPLC, mass spectrometry, tandem mass spectrometry, urine, validation
Zásady pro vypracování
Cílem práce je seznámit se s metodou LC/MS, dále s biologickým materiálem (krevní plazma, moč) a jeho zpracováním za účelem stanovení koncentrace léčiva v dodaném vzorku.
V rámci teoretické části práce bude vypracována rešerše zaměřená na vlastnosti tiotropia, jak z hlediska chemického, tak z hlediska použití. Dále rešerše zaměřená na metodu LC/MS s využitím iontového zdroje ESI a trojitého kvadrupólu a rešerše validace metody.
V rámci praktické části bude zavedena a validována metoda LC/MS na stanovení tiotropia v biologických vzorcích získaných od pacientů z FN Olomouc.
Vypracujte stručný přehled o tiotropiu (chemické vlastnosti, použití, mechanizmus působení).
Důkladně se seznamte s metodou LC/MS.
Proveďte validaci metody na stanovení tiotropia v biologických vzorcích.
Stanovte koncentraci tiotropia v dodaných vzorcích.
Sepište diplomovou práci.
Zásady pro vypracování
Cílem práce je seznámit se s metodou LC/MS, dále s biologickým materiálem (krevní plazma, moč) a jeho zpracováním za účelem stanovení koncentrace léčiva v dodaném vzorku.
V rámci teoretické části práce bude vypracována rešerše zaměřená na vlastnosti tiotropia, jak z hlediska chemického, tak z hlediska použití. Dále rešerše zaměřená na metodu LC/MS s využitím iontového zdroje ESI a trojitého kvadrupólu a rešerše validace metody.
V rámci praktické části bude zavedena a validována metoda LC/MS na stanovení tiotropia v biologických vzorcích získaných od pacientů z FN Olomouc.
Vypracujte stručný přehled o tiotropiu (chemické vlastnosti, použití, mechanizmus působení).
Důkladně se seznamte s metodou LC/MS.
Proveďte validaci metody na stanovení tiotropia v biologických vzorcích.
Stanovte koncentraci tiotropia v dodaných vzorcích.
Sepište diplomovou práci.
Seznam doporučené literatury
[1] Ding L., Tan W., Zhang Y., Shen J., Zhang Z. Sensitive HPLC-ESI-MS method for the determination of tiotropium in human plasma. Journal of Chromatographic Science 2008, 46: 445-449.
[2] Kašák V. Tiotropium. Remedia 2005, 15(3): 205-211.
[3] Krčmová I., Sýkora D. Tiotropium bromid v léčbě bronchiálního astmatu. Remedia 2015, 25(4): 315-318.
[4] Wang J., Jiang Y., Wang Y., Li H., Fawcett J.P., Gu J. Highly sensitive assay for tiotropium, a quaternary ammonium, in human plasma by high-performance-liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007, 21: 1755-1758.
[5] Pohanka M. Základy statistiky laboratorních experimentů. Vojenské zdravotnické listy 2010, 79(2): 60-63.
Seznam doporučené literatury
[1] Ding L., Tan W., Zhang Y., Shen J., Zhang Z. Sensitive HPLC-ESI-MS method for the determination of tiotropium in human plasma. Journal of Chromatographic Science 2008, 46: 445-449.
[2] Kašák V. Tiotropium. Remedia 2005, 15(3): 205-211.
[3] Krčmová I., Sýkora D. Tiotropium bromid v léčbě bronchiálního astmatu. Remedia 2015, 25(4): 315-318.
[4] Wang J., Jiang Y., Wang Y., Li H., Fawcett J.P., Gu J. Highly sensitive assay for tiotropium, a quaternary ammonium, in human plasma by high-performance-liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007, 21: 1755-1758.
[5] Pohanka M. Základy statistiky laboratorních experimentů. Vojenské zdravotnické listy 2010, 79(2): 60-63.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Studentka představila komisi svoji diplomovou práci na téma Využití LC/MS metody pro stanovení tiotropia v biologických vzorcích. Na úvod seznámila přítomné s cíli práce a bromidem tiotropia. Prezentovala jednotlivé kroky optimalizace HPLC/MS metody pro analýzu tiotropia v moči pacientů. Následně představila proces přípravy vzorků. Prezentovala výsledky kalibrace a validace metody. Diskutovala výsledky analýzy moči pacienta. Na závěr shrnula dosažené výsledky.
Vedoucí práce kladně hodnotila práci studentky v laboratoři. Vytkla studentce menší samostatnost během interpretace dat. K předložené práci neměla žádné dotazy a doporučila ji k obhajobě.
Oponent práce nebyl přítomen. V posudku hodnotí práci jako velice zdařilou a nepoložil v něm studentce žádné dotazy k obhajobě. Práci doporučil k obhajobě.
Při veřejné diskuzi byly položeny následující dotazy: Zkoušela jste pro separaci i kolonu C18? Pokud ano, jak vypadala proběhlá analýza ve srovnání se zvolenou SCX kolonou? Podařilo se překonat problémy spojené s opožděným dodáním SPE kolonek? Zvažovala jste využití i jiných kolonek pro přečištění vzorků? V chromatogramu s reálným vzorkem se jedná o MRM přechod? Jak vypadal profil matrice? Porovnávala jste dosažené výsledky z analýzy moči pacienta s tabulkovými hodnotami? Studentka na položené dotazy uspokojivě odpověděla.