Tato bakalářská práce je věnována N-acetylaminotransferase (NATA) z mechu Physcomitrella patens. V teoretické části je popsán metabolismus polyaminů, jejich syntéza a degradace se zaměřením na acetylaci a známé enzymy u rostlin a savců. V experimentální části byl klonován gen PpNATA do expresního vektoru pET-28a. Expresí genu v buňkách E.coli byl získán rekombinantní protein obsahující histidinovou kotvu umožňující purifikaci afinitní chromatografií. Pomocí metody SDS-PAGE byla ověřena produkce proteinu, čistota a metodou nano-diferenciální skenovací fluorimetrie bylo ověřena stabilita proteinu a stabilizace vazbou na acetyl-CoA. Pomocí bioinformatických postupů byla predikována sekundární a terciární struktura proteinu na základě dostupných struktur savčí N-acetylaminotransferasy a dále bylo analyzováno vazebné místo pro vazbu acetyl-CoA v modelu PpNATA.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis is focused on the N-acetyl aminotransferase (NATA) from the moss Physcomitrella patens. The theoretical part describes the metabolism of polyamines, their synthesis and degradation with a focus on acetylation and known enzymes in plants and mammals. In the experimental part, the PpNATA gene was cloned into the expression vector pET-28a. The gene was expressed in E. coli cells yielding a recombinant protein comprising a histidine-tag allowing the affinity chromatography purification. The protein production and purity were verified by
SDS-PAGE, and protein stability and the effect of acetyl-CoA binding was analyzed by the nano-differential scanning fluorimetry. Bioinformatic approaches were used to predict the secondary and tertiary structure of the protein was predicted based on the available structural data of N-acetyl aminotransferases, and the binding site for acetyl-CoA in the PpNATA model was further analyzed.
Tato bakalářská práce je věnována N-acetylaminotransferase (NATA) z mechu Physcomitrella patens. V teoretické části je popsán metabolismus polyaminů, jejich syntéza a degradace se zaměřením na acetylaci a známé enzymy u rostlin a savců. V experimentální části byl klonován gen PpNATA do expresního vektoru pET-28a. Expresí genu v buňkách E.coli byl získán rekombinantní protein obsahující histidinovou kotvu umožňující purifikaci afinitní chromatografií. Pomocí metody SDS-PAGE byla ověřena produkce proteinu, čistota a metodou nano-diferenciální skenovací fluorimetrie bylo ověřena stabilita proteinu a stabilizace vazbou na acetyl-CoA. Pomocí bioinformatických postupů byla predikována sekundární a terciární struktura proteinu na základě dostupných struktur savčí N-acetylaminotransferasy a dále bylo analyzováno vazebné místo pro vazbu acetyl-CoA v modelu PpNATA.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis is focused on the N-acetyl aminotransferase (NATA) from the moss Physcomitrella patens. The theoretical part describes the metabolism of polyamines, their synthesis and degradation with a focus on acetylation and known enzymes in plants and mammals. In the experimental part, the PpNATA gene was cloned into the expression vector pET-28a. The gene was expressed in E. coli cells yielding a recombinant protein comprising a histidine-tag allowing the affinity chromatography purification. The protein production and purity were verified by
SDS-PAGE, and protein stability and the effect of acetyl-CoA binding was analyzed by the nano-differential scanning fluorimetry. Bioinformatic approaches were used to predict the secondary and tertiary structure of the protein was predicted based on the available structural data of N-acetyl aminotransferases, and the binding site for acetyl-CoA in the PpNATA model was further analyzed.
1. Vypracování literární rešerše na téma metabolismus polyaminů, jejich syntézy a degradace a dosavadních poznatků k funkci N-acetyltransferas.
2. Klonování a purifikace N-acetyltransferasy (NATA) z mechu Physcomitrella patens, ověření stability proteinu.
3. Porovnání sekvencí savčích a rostlinných N-acetyltransferas.
4. Predikce sekundární a terciární struktury mechové NATA.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Zásady pro vypracování
1. Vypracování literární rešerše na téma metabolismus polyaminů, jejich syntézy a degradace a dosavadních poznatků k funkci N-acetyltransferas.
2. Klonování a purifikace N-acetyltransferasy (NATA) z mechu Physcomitrella patens, ověření stability proteinu.
3. Porovnání sekvencí savčích a rostlinných N-acetyltransferas.
4. Predikce sekundární a terciární struktury mechové NATA.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k aktuálnímu nastavenému režimu na UP v souvislosti s pandemií Covid-19 v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2020/2021 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá dva svázané výtisky závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. Vzhledem k omezeným možnostem vypalování nemusí být CD s elektronickou verzí součástí BP.
Seznam doporučené literatury
Igarashi, K., Kashiwagi, K. (2019): The functional role of polyamines in eukaryotic cells. The international journal of biochemistry & cell biology, 107, 104\textendash115.
Lou, Y. R., Bor, M., Yan, J., Preuss, A. S., Jander, G. (2016): Arabidopsis NATA1 Acetylates Putrescine and Decreases Defense-Related Hydrogen Peroxide Accumulation. Plant physiology, 171, 1443\textendash1455.
Tavladoraki, P., Cona, A., & Angelini, R. (2016): Copper-Containing Amine Oxidases and FAD-Dependent Polyamine Oxidases Are Key Players in Plant Tissue Differentiation and Organ Development. Frontiers in plant science, 7, 824.
Hein, D. W., Doll, M. A., Fretland, A. J., Leff, M. A., Webb, S. J., Xiao, G. H., Devanaboyina, U. S., Nangju, N. A., Feng, Y. (2000): Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention, 9, 29\textendash42.
Seznam doporučené literatury
Igarashi, K., Kashiwagi, K. (2019): The functional role of polyamines in eukaryotic cells. The international journal of biochemistry & cell biology, 107, 104\textendash115.
Lou, Y. R., Bor, M., Yan, J., Preuss, A. S., Jander, G. (2016): Arabidopsis NATA1 Acetylates Putrescine and Decreases Defense-Related Hydrogen Peroxide Accumulation. Plant physiology, 171, 1443\textendash1455.
Tavladoraki, P., Cona, A., & Angelini, R. (2016): Copper-Containing Amine Oxidases and FAD-Dependent Polyamine Oxidases Are Key Players in Plant Tissue Differentiation and Organ Development. Frontiers in plant science, 7, 824.
Hein, D. W., Doll, M. A., Fretland, A. J., Leff, M. A., Webb, S. J., Xiao, G. H., Devanaboyina, U. S., Nangju, N. A., Feng, Y. (2000): Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention, 9, 29\textendash42.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise představila studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce N-acetylaminotransferasa z mechu Physcomitrella patens student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Student zodpověděl dotazy položené v posudku oponentky. Odpověděl také na dotazy členů zkušební komise:
prof. Petřivalský: Jaká je subcelulární lokalizace enzymů?
prof. Šebela: Co je vzorek 6 na gelu ověřování klonů?
dr. Danihlík: Jsou výsledky predikčních nástrojů totožné?