Dendritické buňky jsou buňky imunitního systému, které propojují jeho vrozenou a získanou část. Patří mezi tzv. profesionální antigen prezentující buňky, které dokáží pohltit antigen pomocí fagocytózy a následně takový antigen rozložit na peptidové fragmenty. Tyto fragmenty poté dendritická buňka vystavuje na svém povrchu pomocí MHC molekul. V rámci diplomové práce byla věnována pozornost MHC I molekule a peptidům nacházejícím se na této molekule. K dendritickým buňkám byl přidán rekombinantní RBD protein pocházející z viru SARS-CoV-2. Pomocí imunoafinitní chromatografie byl komplex MHC I - peptid izolován z buněčného lyzátu. Následovalo štěpení komplexu MHC I - peptid trypsinem a kapalinová chromatografie, kde byly odseparovány jednotlivé peptidy. Identifikace peptidů byla provedena pomocí hmotnostní spektrometrie. Celkově analýza byla provedena 3x z důvodu optimalizace metody. Získané aminokyselinové sekvence peptidů byly následně porovnány pomocí databáze UniProt.
Anotace v angličtině
Dendritic cells are cells of the immune system that connect its innate and adaptive parts. Dendritic cells belong to the group called professional antigen-presenting cells, which can absorb the antigen by phagocytosis and subsequently break down the antigen into peptide fragments. These fragments are then displayed on the cell surface using MHC molecules. Within the diploma thesis, attention was paid to the MHC I molecule and peptides bound on this molecule. To the dendritic cells was added recombinant RBD protein derived from SARS-CoV-2. The MHC I - peptide complex was isolated from the cell lysate by immunoaffinity chromatography. After that complex MHC I - peptide was digested by trypsin and peptides from the complex were separated by liquid chromatography. To the identification of peptides was used mass spectrometry. The analysis was performed 3 times to optimize the method. The obtained amino acid peptide sequences were compared using the UniProt database.
Dendritic cells, Spike protein, receptor binding domain, major histocompatibility complex, mass spectrometry, peptide
Rozsah průvodní práce
64
Jazyk
CZ
Anotace
Dendritické buňky jsou buňky imunitního systému, které propojují jeho vrozenou a získanou část. Patří mezi tzv. profesionální antigen prezentující buňky, které dokáží pohltit antigen pomocí fagocytózy a následně takový antigen rozložit na peptidové fragmenty. Tyto fragmenty poté dendritická buňka vystavuje na svém povrchu pomocí MHC molekul. V rámci diplomové práce byla věnována pozornost MHC I molekule a peptidům nacházejícím se na této molekule. K dendritickým buňkám byl přidán rekombinantní RBD protein pocházející z viru SARS-CoV-2. Pomocí imunoafinitní chromatografie byl komplex MHC I - peptid izolován z buněčného lyzátu. Následovalo štěpení komplexu MHC I - peptid trypsinem a kapalinová chromatografie, kde byly odseparovány jednotlivé peptidy. Identifikace peptidů byla provedena pomocí hmotnostní spektrometrie. Celkově analýza byla provedena 3x z důvodu optimalizace metody. Získané aminokyselinové sekvence peptidů byly následně porovnány pomocí databáze UniProt.
Anotace v angličtině
Dendritic cells are cells of the immune system that connect its innate and adaptive parts. Dendritic cells belong to the group called professional antigen-presenting cells, which can absorb the antigen by phagocytosis and subsequently break down the antigen into peptide fragments. These fragments are then displayed on the cell surface using MHC molecules. Within the diploma thesis, attention was paid to the MHC I molecule and peptides bound on this molecule. To the dendritic cells was added recombinant RBD protein derived from SARS-CoV-2. The MHC I - peptide complex was isolated from the cell lysate by immunoaffinity chromatography. After that complex MHC I - peptide was digested by trypsin and peptides from the complex were separated by liquid chromatography. To the identification of peptides was used mass spectrometry. The analysis was performed 3 times to optimize the method. The obtained amino acid peptide sequences were compared using the UniProt database.
Dendritic cells, Spike protein, receptor binding domain, major histocompatibility complex, mass spectrometry, peptide
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Popis MHCI prezentace antigenu.
Struktura MHCI molekuly, její de novo syntéza i možnosti recyklace
Způsoby predikce peptidů vázaných na MHCI molekulách
Struktura viru SARS-CoV-2
Charakteristika Spike proteinu (RBD)
Hmotnostní spektrometrie
Praktická část
Osvojení si manipulace se savčími buněčnými kulturami
Exprese a purifikace savčích proteinů
Konjugace specifických protilátek s proteinem G
Imunoafinitní purifikace MHCI:peptid
Identifikace peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Zásady pro vypracování
Teoretická část:
Popis MHCI prezentace antigenu.
Struktura MHCI molekuly, její de novo syntéza i možnosti recyklace
Způsoby predikce peptidů vázaných na MHCI molekulách
Struktura viru SARS-CoV-2
Charakteristika Spike proteinu (RBD)
Hmotnostní spektrometrie
Praktická část
Osvojení si manipulace se savčími buněčnými kulturami
Exprese a purifikace savčích proteinů
Konjugace specifických protilátek s proteinem G
Imunoafinitní purifikace MHCI:peptid
Identifikace peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Student odevzdá jeden svázaný výtisk závěrečné práce přímo zkušební komisi v den obhajoby. CD s elektronickou verzí BP/DP není požadováno.
Seznam doporučené literatury
Jensen, S.M., et al., Specific MHC-I Peptides Are Induced Using PROTACs. Front Immunol, 2018. 9: p. 2697.
Kote, S., et al., Mass Spectrometry-Based Identification of MHC-Associated Peptides. Cancers (Basel), 2020. 12(3).
Zhang, X., et al., Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother, 2019. 120: p. 109542.
Zachova, K., M. Krupka, and M. Raska, Antigen Cross-Presentation and Heat Shock Protein-Based Vaccines. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2016. 64(1): p. 1-18.
Konda, P., et al., Enhancing Mass Spectrometry-Based MHC-I Peptide Identification Through a Targeted Database Search Approach. Methods Mol Biol, 2019. 2024: p. 301-307.
Krupka, M., et al., Endotoxin-minimized HIV-1 p24 fused to murine hsp70 activates dendritic cells, facilitates endocytosis and p24-specific Th1 response in mice. Immunol Lett, 2015. 166(1): p. 36-44.
Seznam doporučené literatury
Jensen, S.M., et al., Specific MHC-I Peptides Are Induced Using PROTACs. Front Immunol, 2018. 9: p. 2697.
Kote, S., et al., Mass Spectrometry-Based Identification of MHC-Associated Peptides. Cancers (Basel), 2020. 12(3).
Zhang, X., et al., Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother, 2019. 120: p. 109542.
Zachova, K., M. Krupka, and M. Raska, Antigen Cross-Presentation and Heat Shock Protein-Based Vaccines. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2016. 64(1): p. 1-18.
Konda, P., et al., Enhancing Mass Spectrometry-Based MHC-I Peptide Identification Through a Targeted Database Search Approach. Methods Mol Biol, 2019. 2024: p. 301-307.
Krupka, M., et al., Endotoxin-minimized HIV-1 p24 fused to murine hsp70 activates dendritic cells, facilitates endocytosis and p24-specific Th1 response in mice. Immunol Lett, 2015. 166(1): p. 36-44.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předseda komise prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr. představil studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Identifikace peptidů navázaných na MHCI molekulách pomocí hmotnostní spektrometrie student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucí práce a oponentský posudek. Student zodpověděl dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděl také na dotazy členů zkušební komise:
dr. Danihlík: Jakým způsobem se zpracovaly vzorky pro MALDI analýzu?
dr. Škrabišová: Co je to na konci sekvence proteinu, můžete to více objasnit?
prof. Petřivalský: V práci byste měl citovat hlavně primární literaturu a méně pak učebnice. Jaký další postup byste navrhoval pro navazující experimenty?