Předložená diplomová práce se zabývá zejména genem kódujícím polyfenol oxidázu. Teoretická část pojednává o vývoji semene a jeho jednotlivých částích. Další část je věnována především enzymům, které se podílí na ochraně rostlin. Jedním z nejdůležitějších enzymů je polyfenol oxidáza, spadající do velké rodiny "multi-copper" oxidáz. Praktická část obsahuje in silico analýzu genomu hrachu pomocí homologních lakázových (LAC 1 -17) genů Arabidopsis thaliana. Dále byla analyzována genová exprese nalezených genů ve vybraných pletivech hrachu. Přítomnost různých transkriptů byla ověřena pomocí specifických primerů. Jelikož mezi potencionální substráty polyfenol oxidázy patří i látky ze skupiny flavonoidů, bylo měřeno množství rozpustných a nerozpustných proantokyanidinů v osemení jak planých, tak kulturních genotypů hrachu. Při sekvenování bylo analyzováno celkem 90 genotypů geograficky různě pěstovaného kulturního hrachu a byla odhalena souvislost mezi funkčností polyfenol oxidázy a zbarvení hila. Mezi další testy, které byly provedeny v rámci práce byla analýza obsahu ligninu pomocí acetyl bromidové metody a také byla testována aktivita polyfenol oxidázy u celých semen hrachu. Vztah mezi funkčností polyfenol oxidázy a barvou hila byl testován na rekombinantních inbredních liniích.
Anotace v angličtině
The master master thesis focuses on gene encoding polyphenol oxidase in pea. Introduction part describes the development and structure of the seed. The next part is devoted to the enzymes that are involved in plant protection. One of the most important enzymes is polyphenol oxidase, which belongs to a large family of "multi-copper" oxidases. The practical part contains in silico analysis of the pea genome using Arabidopsis thaliana laccase (LAC 1 -17) genes. Furthermore, the gene expression of selected pea homologoues genes was analyzed in selected pea tissues. Since flavonoids are among potential substrates of polyphenol oxidase, the content of soluble and insoluble proanthocyanidins was measured in the seed coats of both wild and cultured pea genotypes. Sequencing analysis was analyzed of 90 genotypes of geographically spaced cultivated pea has revealed connection between polyphenol oxidase functionality and hilum color. Furthemore the content of lignin using the acetyl bromide method was also determined as well as polyphenol oxidase activity in whole pea seeds. The relationship between functionality of polyphenol oxidase and hilum colour has been tested in recombinant inbred lines.
Předložená diplomová práce se zabývá zejména genem kódujícím polyfenol oxidázu. Teoretická část pojednává o vývoji semene a jeho jednotlivých částích. Další část je věnována především enzymům, které se podílí na ochraně rostlin. Jedním z nejdůležitějších enzymů je polyfenol oxidáza, spadající do velké rodiny "multi-copper" oxidáz. Praktická část obsahuje in silico analýzu genomu hrachu pomocí homologních lakázových (LAC 1 -17) genů Arabidopsis thaliana. Dále byla analyzována genová exprese nalezených genů ve vybraných pletivech hrachu. Přítomnost různých transkriptů byla ověřena pomocí specifických primerů. Jelikož mezi potencionální substráty polyfenol oxidázy patří i látky ze skupiny flavonoidů, bylo měřeno množství rozpustných a nerozpustných proantokyanidinů v osemení jak planých, tak kulturních genotypů hrachu. Při sekvenování bylo analyzováno celkem 90 genotypů geograficky různě pěstovaného kulturního hrachu a byla odhalena souvislost mezi funkčností polyfenol oxidázy a zbarvení hila. Mezi další testy, které byly provedeny v rámci práce byla analýza obsahu ligninu pomocí acetyl bromidové metody a také byla testována aktivita polyfenol oxidázy u celých semen hrachu. Vztah mezi funkčností polyfenol oxidázy a barvou hila byl testován na rekombinantních inbredních liniích.
Anotace v angličtině
The master master thesis focuses on gene encoding polyphenol oxidase in pea. Introduction part describes the development and structure of the seed. The next part is devoted to the enzymes that are involved in plant protection. One of the most important enzymes is polyphenol oxidase, which belongs to a large family of "multi-copper" oxidases. The practical part contains in silico analysis of the pea genome using Arabidopsis thaliana laccase (LAC 1 -17) genes. Furthermore, the gene expression of selected pea homologoues genes was analyzed in selected pea tissues. Since flavonoids are among potential substrates of polyphenol oxidase, the content of soluble and insoluble proanthocyanidins was measured in the seed coats of both wild and cultured pea genotypes. Sequencing analysis was analyzed of 90 genotypes of geographically spaced cultivated pea has revealed connection between polyphenol oxidase functionality and hilum color. Furthemore the content of lignin using the acetyl bromide method was also determined as well as polyphenol oxidase activity in whole pea seeds. The relationship between functionality of polyphenol oxidase and hilum colour has been tested in recombinant inbred lines.
Úlohou osemení je jednak ochrana embrya před okolním prostředím, ale rovněž i zprostředkování komunikace mezi okolím a embryem, poskytujícím informaci o době vhodné k vyklíčení. Dormance semen, je naopak mechanismem umožňujícím rozložení rizika. V průběhu evoluce se vyvinuly různé mechanismy dormance. Jedním z nich je fyzikálně podmíněná dormance, zprostředkovaná právě osemením regulujícím vstup vody do semene. Polyfenol oxidázu (PPO) detekovaná v osemení včetně hrachu, se podílí na hydroxalaci a oxidaci fenolických látek. Tyto látky se pravděpodobně účastní na vzniku bariéry průniku vody, a zároveň také mají antimikrobiální a antifungální účinky. Při našem studiu dormance semen hrachu jsme detekovali PPO gen jako diferenciálně exprimovaný mezi různými genotypy.
Cílem práce je analyzovat sekvenční polymorfismus, genovou expresi a enzymatickou aktivitu polyfenol oxidázy v osemení planého a kulturního hrachu (Pisum sp.)
1) Teoretická část: literární rešerše na téma vývoje semen a klíčení.
2) Praktická část: sekvenční analýza genu pro polyfenol oxidázu (PPO) ve vybraných genotypech hrachu, analýza genové exprese během vývoje semen pomocí qRT-PCR, detekce PPO enzymu.
Zásady pro vypracování
Úlohou osemení je jednak ochrana embrya před okolním prostředím, ale rovněž i zprostředkování komunikace mezi okolím a embryem, poskytujícím informaci o době vhodné k vyklíčení. Dormance semen, je naopak mechanismem umožňujícím rozložení rizika. V průběhu evoluce se vyvinuly různé mechanismy dormance. Jedním z nich je fyzikálně podmíněná dormance, zprostředkovaná právě osemením regulujícím vstup vody do semene. Polyfenol oxidázu (PPO) detekovaná v osemení včetně hrachu, se podílí na hydroxalaci a oxidaci fenolických látek. Tyto látky se pravděpodobně účastní na vzniku bariéry průniku vody, a zároveň také mají antimikrobiální a antifungální účinky. Při našem studiu dormance semen hrachu jsme detekovali PPO gen jako diferenciálně exprimovaný mezi různými genotypy.
Cílem práce je analyzovat sekvenční polymorfismus, genovou expresi a enzymatickou aktivitu polyfenol oxidázy v osemení planého a kulturního hrachu (Pisum sp.)
1) Teoretická část: literární rešerše na téma vývoje semen a klíčení.
2) Praktická část: sekvenční analýza genu pro polyfenol oxidázu (PPO) ve vybraných genotypech hrachu, analýza genové exprese během vývoje semen pomocí qRT-PCR, detekce PPO enzymu.
Seznam doporučené literatury
Bewley, J. D., Bradford, K., Hilhorst, H., Nonogaki, H. (2013) Seeds: Physiology of Development, Germination Dormancy, 3rd edition.
Bradford K.J., Hiroyuki N. (2015) Seed Development, Dormancy and Germination. Blackwell.
Hradilová I., Trněný O., et al. Smýkal P. (2017) A combined comparative transcriptomic, metabolomic, and anatomical analyses of two key domestication traits: Pod dehiscence and seed dormancy in pea (Pisum sp.). Front. Plant Sci. 8: 542e
Marbach I., Mayer AM. (1975) Changes in catechol oxidase and permeability to water in seed coats of pisum elatius during seed development and maturation. Plant Physiol. (1975) 56, 93-96
Marbach, I, Mayer AM. (1974) Permeability of seed coats to water as related to drying conditions and metabolism of phenolics. Plant Physiol. 54:817-820.
Pollard, A.T. (2018). Seeds vs fungi: an enzymatic battle in the soil seedbank. Seed Science Research, 28, 197?214.
Smýkal P., Vernoud V., Blair MW., Soukup A., Thompson RD. (2014) The role of the testa during development and in establishment of dormancy of the legume seed. Front. Plant Sci. 5: 351.
Trněný O, Brus J, Hradilová I, Rathore A, Das RR, Kopecký P, Coyne CJ, Reeves P, Richards C, Smýkal P. (2018) Molecular evidence for two domestication events in the pea crop. Genes 9, 535
Weber H., Borisjuk L., Wobus U. (2005) Molecular physiology of legume seed development. Annu. Rev. Plant Biol. 56, 253?279
Seznam doporučené literatury
Bewley, J. D., Bradford, K., Hilhorst, H., Nonogaki, H. (2013) Seeds: Physiology of Development, Germination Dormancy, 3rd edition.
Bradford K.J., Hiroyuki N. (2015) Seed Development, Dormancy and Germination. Blackwell.
Hradilová I., Trněný O., et al. Smýkal P. (2017) A combined comparative transcriptomic, metabolomic, and anatomical analyses of two key domestication traits: Pod dehiscence and seed dormancy in pea (Pisum sp.). Front. Plant Sci. 8: 542e
Marbach I., Mayer AM. (1975) Changes in catechol oxidase and permeability to water in seed coats of pisum elatius during seed development and maturation. Plant Physiol. (1975) 56, 93-96
Marbach, I, Mayer AM. (1974) Permeability of seed coats to water as related to drying conditions and metabolism of phenolics. Plant Physiol. 54:817-820.
Pollard, A.T. (2018). Seeds vs fungi: an enzymatic battle in the soil seedbank. Seed Science Research, 28, 197?214.
Smýkal P., Vernoud V., Blair MW., Soukup A., Thompson RD. (2014) The role of the testa during development and in establishment of dormancy of the legume seed. Front. Plant Sci. 5: 351.
Trněný O, Brus J, Hradilová I, Rathore A, Das RR, Kopecký P, Coyne CJ, Reeves P, Richards C, Smýkal P. (2018) Molecular evidence for two domestication events in the pea crop. Genes 9, 535
Weber H., Borisjuk L., Wobus U. (2005) Molecular physiology of legume seed development. Annu. Rev. Plant Biol. 56, 253?279
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Radky Vaculíkové zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce doc. Ing. Petra Smýkala, Ph.D. a oponenta doc. Ing. Pavla Hanáčka, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- Vývoj semene, jednotlivá stádia
- Dormance
- Polyfenol oxidáza - role enzymu
- Design experimentální práce
- Identifikace homologů Ath LAC1-17 genu v genomu hrachu, identifikace polyfenoloxidáz, lakáz a askorbát oxidáz; jejich rozdělení do skupin
- Analýza genové exprese
- Sekvenční analýza PPO
- Proanthokyanidy - rozpustné a nerozpustné PA v průběhu vývoje semen
- Analýza PPO v celých semenech - vztah mezi aktivitou a zbarvením hila
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- JI92 nese funkční PPO, regulace tohoto genu?
- Pokračování této práce
- Hodnocení exprese sledovaných genů, metody vhodné pro průkaz rozdílů/změn genové exprese
- Zbarvení hila, příčiny tmavé pigmentace
- Struktura PPO genu, přítomnost stop kodonu
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala adekvátně, s mírnými zaváháními.