Informace o kvalifikační práci Studium mitogen aktivovaných proteinkinas YODA a MPK3 pod nativním promotorem u modelového organismu Arabidopsis thaliana
Mitogen aktivované proteinkinasy jsou esenciální pro adaptaci organismů na vnější podmínky, ale také se zapojují do vývojových procesů v buňce. MPK3 a YODA jsou důležité pro vývoj stomat, embryogenezi nebo růst rostlin. Samotná MPK3 je nezbytná pro reakci na abiotický stres způsobený vysokou salinitou nebo kyslíkovými radikály. Hlavními cíli této práce bylo molekulární klonování YODA pod nativním promotorem v C- terminální fúzi s GFP nebo RFP a dále komplementace MPK3 genu v mpk3 mutantních rostlinách Arabidopsis thaliana. Klonováním byly připraveny čtyři konstrukty pro expresi YODA pod nativním promotorem ve fúzi s GFP nebo RFP. Konstrukty byly testovány transientní transformací Nicotiana benthamiana a následně byly použity pro stabilní transformaci A. thaliana. Fúzní protein YODA-GFP byl detekován ve dvou rostlinách, což bylo poté potvrzeno i mikroskopií. Nepodařilo se selektovat žádné rostliny s YODA-RFP fúzním proteinem. Mutantní linie mpk3-1 a mpk3-5 A. thaliana s vyřazeným genem MPK3 byly transformované konstruktem exprimujícím MPK3 pod nativním promotorem ve fúzi s mCherry na C- konci. Protein MPK3-mCherry byl detekován ve velkém množství rostlin, z kterých byly selektovány homozygotní linie v generaci T3. Mikroskopickou analýzou těchto linií bylo objeveno, že MPK3-mCherry je abundantní především v cytoplasmě a jádře buněk.
Anotace v angličtině
Mitogen-activated protein kinases are essential for organism adaptation to environmental conditions, but they also take part in developmental processes. MPK3 and YODA are crucial for development of stomata, embryogenesis or plant growth. MPK3 is involved in reaction to abiotic stress caused by high salinity or reactive oxygen species. The main goals of this thesis were molecular cloning of YODA with its own promotor with GFP or RFP C-terminal fusion and complementation of MPK3 gene in mpk3-1 and mpk3-5 Arabidopsis thaliana mutant plants. Four different constructs for YODA with its own promotor and C- terminal fusion with either GFP or RFP were prepared and tested with transient transformation of Nicotiana benthamiana and used for stable transformation of A. thaliana. Protein YODA GFP was detected in two plants and the presence of the protein was later confirmed by microscopy. However, no plants with YODA-RFP protein were detected. Mutant lines mpk3-1 and mpk3-5 of A. thaliana without functional MPK3 gene were transformed with construct with MPK3 and its own promotor with mCherry on C- terminus. Presence of MPK3 mCherry was confirmed in large number of plants from which T3 generation of homozygous lines were selected and showed localization of MPK3-mCherry mainly in cytoplasm and nucleus of the cells.
mitogen-activated protein kinases (MAPKs), YODA, MPK3, Arabidopsis thaliana, salt stress, GFP, mCherry
Rozsah průvodní práce
95
Jazyk
CZ
Anotace
Mitogen aktivované proteinkinasy jsou esenciální pro adaptaci organismů na vnější podmínky, ale také se zapojují do vývojových procesů v buňce. MPK3 a YODA jsou důležité pro vývoj stomat, embryogenezi nebo růst rostlin. Samotná MPK3 je nezbytná pro reakci na abiotický stres způsobený vysokou salinitou nebo kyslíkovými radikály. Hlavními cíli této práce bylo molekulární klonování YODA pod nativním promotorem v C- terminální fúzi s GFP nebo RFP a dále komplementace MPK3 genu v mpk3 mutantních rostlinách Arabidopsis thaliana. Klonováním byly připraveny čtyři konstrukty pro expresi YODA pod nativním promotorem ve fúzi s GFP nebo RFP. Konstrukty byly testovány transientní transformací Nicotiana benthamiana a následně byly použity pro stabilní transformaci A. thaliana. Fúzní protein YODA-GFP byl detekován ve dvou rostlinách, což bylo poté potvrzeno i mikroskopií. Nepodařilo se selektovat žádné rostliny s YODA-RFP fúzním proteinem. Mutantní linie mpk3-1 a mpk3-5 A. thaliana s vyřazeným genem MPK3 byly transformované konstruktem exprimujícím MPK3 pod nativním promotorem ve fúzi s mCherry na C- konci. Protein MPK3-mCherry byl detekován ve velkém množství rostlin, z kterých byly selektovány homozygotní linie v generaci T3. Mikroskopickou analýzou těchto linií bylo objeveno, že MPK3-mCherry je abundantní především v cytoplasmě a jádře buněk.
Anotace v angličtině
Mitogen-activated protein kinases are essential for organism adaptation to environmental conditions, but they also take part in developmental processes. MPK3 and YODA are crucial for development of stomata, embryogenesis or plant growth. MPK3 is involved in reaction to abiotic stress caused by high salinity or reactive oxygen species. The main goals of this thesis were molecular cloning of YODA with its own promotor with GFP or RFP C-terminal fusion and complementation of MPK3 gene in mpk3-1 and mpk3-5 Arabidopsis thaliana mutant plants. Four different constructs for YODA with its own promotor and C- terminal fusion with either GFP or RFP were prepared and tested with transient transformation of Nicotiana benthamiana and used for stable transformation of A. thaliana. Protein YODA GFP was detected in two plants and the presence of the protein was later confirmed by microscopy. However, no plants with YODA-RFP protein were detected. Mutant lines mpk3-1 and mpk3-5 of A. thaliana without functional MPK3 gene were transformed with construct with MPK3 and its own promotor with mCherry on C- terminus. Presence of MPK3 mCherry was confirmed in large number of plants from which T3 generation of homozygous lines were selected and showed localization of MPK3-mCherry mainly in cytoplasm and nucleus of the cells.
mitogen-activated protein kinases (MAPKs), YODA, MPK3, Arabidopsis thaliana, salt stress, GFP, mCherry
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je samostatné vypracování literární rešerše týkající se problematiky mitogen aktivovaných proteinkinas a také zvládnutí laboratorních metod, jako jsou: molekulární klonování konstruktů, transformace A. thaliana, Wester-blot a genotypová analýza.
V rámci teoretické části bude vypracována rešerše zaměřená na problematiku:
Přehled publikací o mitogen aktivovaných proteinkinas v modelovém organismu Arabidopsis thaliana
Přehled signálních drah mitogen aktivovaných proteinkinas se zaměřením na YODA a MPK3 a jejich společných signálních drah při odpovědi na stres a vývoj rostlin.
V praktické části budou realizovány experimenty zaměřené na molekulární klonování konstruktů pro expresi YODA proteinu ve fúzi s fluorescenčním proteinem GFP nebo RFP, následnou stabilní transformaci Arabidopsis thaliana a dále na komplementaci MPK3 genu v mpk3 mutantních rostlinách Arabidopsis thaliana. Metody pro dosažení praktických cílů diplomové práce jsou:
Molekulární klonování konstruktů pro expresi YODA značeného proteinu pod nativním promotorem ve fúzi s GFP nebo RFP na C- konci.
Genotypová a biochemická analýza stabilně transformovaných linií Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR a metody Western-blot.
Aplikace solného stresu na komplementované linie v MPK3 genu.
Studium lokalizace fúzních proteinů pomocí konfokální mikroskopie.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Zásady pro vypracování
Cílem diplomové práce je samostatné vypracování literární rešerše týkající se problematiky mitogen aktivovaných proteinkinas a také zvládnutí laboratorních metod, jako jsou: molekulární klonování konstruktů, transformace A. thaliana, Wester-blot a genotypová analýza.
V rámci teoretické části bude vypracována rešerše zaměřená na problematiku:
Přehled publikací o mitogen aktivovaných proteinkinas v modelovém organismu Arabidopsis thaliana
Přehled signálních drah mitogen aktivovaných proteinkinas se zaměřením na YODA a MPK3 a jejich společných signálních drah při odpovědi na stres a vývoj rostlin.
V praktické části budou realizovány experimenty zaměřené na molekulární klonování konstruktů pro expresi YODA proteinu ve fúzi s fluorescenčním proteinem GFP nebo RFP, následnou stabilní transformaci Arabidopsis thaliana a dále na komplementaci MPK3 genu v mpk3 mutantních rostlinách Arabidopsis thaliana. Metody pro dosažení praktických cílů diplomové práce jsou:
Molekulární klonování konstruktů pro expresi YODA značeného proteinu pod nativním promotorem ve fúzi s GFP nebo RFP na C- konci.
Genotypová a biochemická analýza stabilně transformovaných linií Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR a metody Western-blot.
Aplikace solného stresu na komplementované linie v MPK3 genu.
Studium lokalizace fúzních proteinů pomocí konfokální mikroskopie.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie .https://www.prf.upol.cz/katedra-biochemie/studium/bakalarske-a-diplomove-prace/
Práce bude studentem nejdříve vložena v elektronické podobě ve formátu pdf do systému STAG a doplněna povinnými údaji o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci), a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Odevzdání závěrečné práce na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce proběhne v termínu uvedeném v Pokynech pro odevzdávání prací
na webové stránce Oddělení buněčné biologie CRH.http://cr-hana.upol.cz/cellbiol/
Seznam doporučené literatury
Colcombet J., Sözen C., Hirt H. (2016): Convergence of Multiple MAP3Ks on MKK3 Identifies a Set of Novel Stress MAPK Modules. Frontiers in Plant Science7.
de Zelicourt A., Colcombet J., Hirt H. (2016): The Role of MAPK Modules and ABA during Abiotic Stress Signaling. Trends in Plant Science21, 677?685.
Doskočilová A., Luptovčiak I., Smékalová V., Samaj J. (2014): Fluorescent protein tagging of Arabidopsis MAPKs for in vivo localization studies. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)1171, 131?145.
Hettenhausen C., Schuman M. C., Wu J. (2015): MAPK signaling: a key element in plant defense response to insects. Insect Science22, 157?164.
Chardin C., Schenk S. T., Hirt H., Colcombet J., Krapp A. (2017): Review: Mitogen-Activated Protein Kinases in nutritional signaling in Arabidopsis. Plant Science260, 101?108.
Jalmi S. K., Sinha A. K. (2015): ROS mediated MAPK signaling in abiotic and biotic stress- striking similarities and differences. Frontiers in Plant Science6, 769.
Jiang L., Chen Y., Luo L., Peck S. C. (2018): Central Roles and Regulatory Mechanisms of Dual-Specificity MAPK Phosphatases in Developmental and Stress Signaling. Frontiers in Plant Science9.
Komis G., Šamajová O., Ovečka M., Šamaj J. (2018): Cell and Developmental Biology of Plant Mitogen-Activated Protein Kinases. Annual Review of Plant Biology69, 237?265.
Krenek P., Samajova O., Luptovciak I., Doskocilova A., Komis G., Samaj J. (2015): Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnology Advances33, 1024?1042.
Krysan P. J., Colcombet J. (2018): Cellular Complexity in MAPK Signaling in Plants: Questions and Emerging Tools to Answer Them. Frontiers in Plant Science9.
Liang Y.-J., Yang W.-X. (2019): Kinesins in MAPK cascade: How kinesin motors are involved in the MAPK pathway? Gene684, 1?9.
Meng X., Wang H., He Y., Liu Y., Walker J. C., Torii K. U., Zhang S. (2012): A MAPK Cascade Downstream of ERECTA Receptor-Like Protein Kinase Regulates Arabidopsis Inflorescence Architecture by Promoting Localized Cell Proliferation. The Plant Cell24, 4948?4960.
Pitzschke A. (2015): Modes of MAPK substrate recognition and control. Trends in Plant Science20, 49?55.
Rodriguez M. C. S., Petersen M., Mundy J. (2010): Mitogen-activated protein kinase signaling in plants. Annual Review of Plant Biology61, 621?649.
Smékalová V., Doskočilová A., Komis G., Samaj J. (2014): Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances32, 2?11.
Šamajová O., Komis G., Šamaj J. (2013): Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science18, 140?148.
Zhang M., Su J., Zhang Y., Xu J., Zhang S. (2018): Conveying endogenous and exogenous signals: MAPK cascades in plant growth and defense. Current Opinion in Plant Biology45, 1?10.
Zhang Y., Wang P., Shao W., Zhu J.-K., Dong J. (2015): The BASL polarity protein con
Seznam doporučené literatury
Colcombet J., Sözen C., Hirt H. (2016): Convergence of Multiple MAP3Ks on MKK3 Identifies a Set of Novel Stress MAPK Modules. Frontiers in Plant Science7.
de Zelicourt A., Colcombet J., Hirt H. (2016): The Role of MAPK Modules and ABA during Abiotic Stress Signaling. Trends in Plant Science21, 677?685.
Doskočilová A., Luptovčiak I., Smékalová V., Samaj J. (2014): Fluorescent protein tagging of Arabidopsis MAPKs for in vivo localization studies. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)1171, 131?145.
Hettenhausen C., Schuman M. C., Wu J. (2015): MAPK signaling: a key element in plant defense response to insects. Insect Science22, 157?164.
Chardin C., Schenk S. T., Hirt H., Colcombet J., Krapp A. (2017): Review: Mitogen-Activated Protein Kinases in nutritional signaling in Arabidopsis. Plant Science260, 101?108.
Jalmi S. K., Sinha A. K. (2015): ROS mediated MAPK signaling in abiotic and biotic stress- striking similarities and differences. Frontiers in Plant Science6, 769.
Jiang L., Chen Y., Luo L., Peck S. C. (2018): Central Roles and Regulatory Mechanisms of Dual-Specificity MAPK Phosphatases in Developmental and Stress Signaling. Frontiers in Plant Science9.
Komis G., Šamajová O., Ovečka M., Šamaj J. (2018): Cell and Developmental Biology of Plant Mitogen-Activated Protein Kinases. Annual Review of Plant Biology69, 237?265.
Krenek P., Samajova O., Luptovciak I., Doskocilova A., Komis G., Samaj J. (2015): Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnology Advances33, 1024?1042.
Krysan P. J., Colcombet J. (2018): Cellular Complexity in MAPK Signaling in Plants: Questions and Emerging Tools to Answer Them. Frontiers in Plant Science9.
Liang Y.-J., Yang W.-X. (2019): Kinesins in MAPK cascade: How kinesin motors are involved in the MAPK pathway? Gene684, 1?9.
Meng X., Wang H., He Y., Liu Y., Walker J. C., Torii K. U., Zhang S. (2012): A MAPK Cascade Downstream of ERECTA Receptor-Like Protein Kinase Regulates Arabidopsis Inflorescence Architecture by Promoting Localized Cell Proliferation. The Plant Cell24, 4948?4960.
Pitzschke A. (2015): Modes of MAPK substrate recognition and control. Trends in Plant Science20, 49?55.
Rodriguez M. C. S., Petersen M., Mundy J. (2010): Mitogen-activated protein kinase signaling in plants. Annual Review of Plant Biology61, 621?649.
Smékalová V., Doskočilová A., Komis G., Samaj J. (2014): Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnology Advances32, 2?11.
Šamajová O., Komis G., Šamaj J. (2013): Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends in Plant Science18, 140?148.
Zhang M., Su J., Zhang Y., Xu J., Zhang S. (2018): Conveying endogenous and exogenous signals: MAPK cascades in plant growth and defense. Current Opinion in Plant Biology45, 1?10.
Zhang Y., Wang P., Shao W., Zhu J.-K., Dong J. (2015): The BASL polarity protein con
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku vedoucího diplomové práce a oponenta studentka zodpověděla.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Doc. Takáč: Můžete porovnat lokalizaci MPK3-mCherry s doposud publikovanými výsledky?