V této diplomové práci se zabývám diferenciální lokalizací a dynamikou dvou dominantních proteinů asociovaných s mikrotubuly Arabidopsis thaliana tvořících svazky mikrotubulů. První proteinem je MAP65-2, který je všudypřítomný a je spojen s kortikálním mikrotubulárním systémem a s vyvíjejícím se cytokinetickým aparátem - fragmoplastem. Druhým je MAP65-3, který asociuje výhradně s mitotickými a cytokinetickými systémy mikrotubulů. Sledovali jsme distribuci obou proteinů v semenáčcích Arabidopsis thaliana exprimujících značené verze obou proteinů. Pozorovali jsme také dynamiku MAP65-2 pomocí konfokálního mikroskopu s rotujícím diskem nebo mikroskopie se strukturovaným osvětlením a identifikovali jsme nový mechanismus distribuce MAP65-2 ve vyvíjejícím se fragmoplastu. Byli jsme schopni vizualizovat MAP65-2 i MAP65-3 a jejich vztah k mikrotubulům ve vhodně transformovaných živých buňkách a pomocí imunoznačení ukázat, že se vzory lokalizací obou proteinů nepřekrývají.
Anotace v angličtině
In the present thesis, I study the differential localization and the dynamics of two dominant microtubule associated proteins of Arabidopsis thaliana with a role in microtubule bundling. The first protein MAP65-2 is ubiquitous and associated with cortical microtubule systems and with the developing cytokinetic apparatus the phragmoplast. The second, MAP65-3 exclusively associates with mitotic and cytokinetic microtubule systems. We followed the distribution of both proteins in seedlings of A. thaliana expressing tagged versions of either protein. We followed the dynamics of MAP65-2 by means of spinning disc or structured illumination microscopy and we identified a novel mechanism of MAP65-2 loading in the developing phragmoplast. In appropriately transformed living cells and by means of immunolabeling we were able to covisualize both MAP65-2 and MAP65-3 in relation to microtubules and to show that both proteins have non-overlapping patterns of localization.
V této diplomové práci se zabývám diferenciální lokalizací a dynamikou dvou dominantních proteinů asociovaných s mikrotubuly Arabidopsis thaliana tvořících svazky mikrotubulů. První proteinem je MAP65-2, který je všudypřítomný a je spojen s kortikálním mikrotubulárním systémem a s vyvíjejícím se cytokinetickým aparátem - fragmoplastem. Druhým je MAP65-3, který asociuje výhradně s mitotickými a cytokinetickými systémy mikrotubulů. Sledovali jsme distribuci obou proteinů v semenáčcích Arabidopsis thaliana exprimujících značené verze obou proteinů. Pozorovali jsme také dynamiku MAP65-2 pomocí konfokálního mikroskopu s rotujícím diskem nebo mikroskopie se strukturovaným osvětlením a identifikovali jsme nový mechanismus distribuce MAP65-2 ve vyvíjejícím se fragmoplastu. Byli jsme schopni vizualizovat MAP65-2 i MAP65-3 a jejich vztah k mikrotubulům ve vhodně transformovaných živých buňkách a pomocí imunoznačení ukázat, že se vzory lokalizací obou proteinů nepřekrývají.
Anotace v angličtině
In the present thesis, I study the differential localization and the dynamics of two dominant microtubule associated proteins of Arabidopsis thaliana with a role in microtubule bundling. The first protein MAP65-2 is ubiquitous and associated with cortical microtubule systems and with the developing cytokinetic apparatus the phragmoplast. The second, MAP65-3 exclusively associates with mitotic and cytokinetic microtubule systems. We followed the distribution of both proteins in seedlings of A. thaliana expressing tagged versions of either protein. We followed the dynamics of MAP65-2 by means of spinning disc or structured illumination microscopy and we identified a novel mechanism of MAP65-2 loading in the developing phragmoplast. In appropriately transformed living cells and by means of immunolabeling we were able to covisualize both MAP65-2 and MAP65-3 in relation to microtubules and to show that both proteins have non-overlapping patterns of localization.
1. Study of literature regarding the major classes of protein kinases regulating microtubules in plants
2. Experimental approach: Transformation of protein kinase mutants of Arabidopsis thaliana with fluorescent microtubule reporter proteins
3. Live imaging of eGFP-MAP65-2 and eGFP-MAP65-3
4. Post-acquisition image analysis
5. Wholemount immunolabeling of eGFP-MAP65-2, eGFP-MAP65-3 and a-tubulin
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
1. Study of literature regarding the major classes of protein kinases regulating microtubules in plants
2. Experimental approach: Transformation of protein kinase mutants of Arabidopsis thaliana with fluorescent microtubule reporter proteins
3. Live imaging of eGFP-MAP65-2 and eGFP-MAP65-3
4. Post-acquisition image analysis
5. Wholemount immunolabeling of eGFP-MAP65-2, eGFP-MAP65-3 and a-tubulin
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
1. Lucas JR, Shaw SL. MAP65-1 and MAP65-2 promote cell proliferation and axial growth in Arabidopsis roots. Plant J. 2012 Aug;71(3):454-63
2. Lucas JR, Courtney S, Hassfurder M, Dhingra S, Bryant A, Shaw SL. Microtubule-associated proteins MAP65-1 and MAP65-2 positively regulate axial cell growth in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Plant Cell. 2011 May;23(5):1889-903
3. Herrmann A, Livanos P, Lipka E, Gadeyne A, Hauser MT, Van Damme D, Müller S.Dual localized kinesin-12 POK2 plays multiple roles during cell division and interacts with MAP65-3. EMBO Rep. 2018 Sep;19(9). pii: e46085. doi: 10.15252/embr.201846085
4. Steiner A, Rybak K, Altmann M, McFarlane HE, Klaeger S, Nguyen N, Facher E, Ivakov A, Wanner G, Kuster B, Persson S, Braun P, Hauser MT, Assaad FF.
Cell cycle-regulated PLEIADE/AtMAP65-3 links membrane and microtubule dynamics during plant cytokinesis. Plant J. 2016 Nov;88(4):531-541
5. Ho CM, Lee YR, Kiyama LD, Dinesh-Kumar SP, Liu B. Arabidopsis microtubule-associated protein MAP65-3 cross-links antiparallel microtubules toward their plus ends in the phragmoplast via its distinct C-terminal microtubule binding domain. Plant Cell. 2012 May;24(5):2071-85
Seznam doporučené literatury
1. Lucas JR, Shaw SL. MAP65-1 and MAP65-2 promote cell proliferation and axial growth in Arabidopsis roots. Plant J. 2012 Aug;71(3):454-63
2. Lucas JR, Courtney S, Hassfurder M, Dhingra S, Bryant A, Shaw SL. Microtubule-associated proteins MAP65-1 and MAP65-2 positively regulate axial cell growth in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Plant Cell. 2011 May;23(5):1889-903
3. Herrmann A, Livanos P, Lipka E, Gadeyne A, Hauser MT, Van Damme D, Müller S.Dual localized kinesin-12 POK2 plays multiple roles during cell division and interacts with MAP65-3. EMBO Rep. 2018 Sep;19(9). pii: e46085. doi: 10.15252/embr.201846085
4. Steiner A, Rybak K, Altmann M, McFarlane HE, Klaeger S, Nguyen N, Facher E, Ivakov A, Wanner G, Kuster B, Persson S, Braun P, Hauser MT, Assaad FF.
Cell cycle-regulated PLEIADE/AtMAP65-3 links membrane and microtubule dynamics during plant cytokinesis. Plant J. 2016 Nov;88(4):531-541
5. Ho CM, Lee YR, Kiyama LD, Dinesh-Kumar SP, Liu B. Arabidopsis microtubule-associated protein MAP65-3 cross-links antiparallel microtubules toward their plus ends in the phragmoplast via its distinct C-terminal microtubule binding domain. Plant Cell. 2012 May;24(5):2071-85
Přílohy volně vložené
CD ROM
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, Dr.Sc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Dr. Krasylenko: V práci je prezentován sumární model distribuce MAP65-2 a MAP65-3 proteinů v procese cytokineze u rostlinných buněk. Jsou experimentální data získána v práci v souladu s tímto modelem?
Doc. Takáč: Může za určitých okolností dojít k rozpadu svazků mikrotubulů jejich vzájemným oddělením (ne rozpadem) a mohou v tomto procesu sehrávat nějakou úlohu MAP65 proteiny?
Prof. Šamaj: Na jakém principu funguje pohyb MAP65 proteinů po povrchu mikrotubulů? Jsou k tomuto pohybu vyžadovány kinesiny? Jsou známy nějaké data z kinezinových mutantů o případné delokalizaci MAP65 proteinů?
Doc. Ovečka: Jaké efekty na proces cytokineze bychom mohli očekávat při nadprodukci MAP65-3 proteinů v rostlinách?