AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) proteiny představují velkou rodinu transkripčních faktorů, jejichž funkcí je aktivace nebo represe genů primární odpovědi na auxin. ARF jako součást auxinové signální dráhy regulují mnoho vývojových procesů rostlin. Byla studována role ARF proteinů v procesu zakládání a vývoje nodálních kořenů v ječmenu. V této práci bylo identifikováno 21 ARF proteinů v ječmenu, z nichž 8 ARF byla predikována funkce aktivátorů a 13 funkce represorů. Byla vytvořena teplotní mapa exprese ARF, která ukazuje, že většina ARF genů je exprimována napříč různými pletivy ječmene a úroveň jejich exprese se mění během vývoje. U ARF represorů byly pozorovány změny v expresních profilech během raného vývoje báze stonku, které naznačují roli těchto ARF v procesu tvorby nodálních kořenů. Pro budoucí analýzu prostorového rozložení ARF transkriptů v bázi stonku byl zdokonalen protokol in situ PCR a byly navrženy další kroky pro optimalizaci této metody. V následující části práce byl určen kandidátní ARF na funkci hlavního inhibitoru nodálních kořenů v ječmenu. Byly připraveny konstrukty pro vypnutí kandidátního genu HvARF13 pomocí CRISPR-Cas9. Metodou transformace nezralých embryí ječmene pomocí Agrobacterium tumefaciens bylo získáno 6 transgenních rostlin. Mutace v sekvenci HvARF13 byla potvrzena u jedné rostliny. Výsledky prezentované v této práci pomohou dále charakterizovat roli ARF v ječmenu.
Anotace v angličtině
AUXIN RESPONSE FACTORs (ARFs) represent a large family of transcription factors, that function as either activators or repressors of the early auxin-responsive genes. As a part of the auxin signaling pathway, ARFs regulate many developmental processes in plants. The role of ARFs in the process of crown-root initiation and development in barley was studied. In this work, 21 ARF proteins were identified in barley. From these, 8 ARFs were predicted to act as activators and 13 as repressors. A heat-map of ARF expression was generated, showing that most ARF genes are expressed among different barley tissues and the level of their expression varies during development. Focusing on the ARF repressors, changes in the expression profiles during the early crown development were observed, suggesting a role of these ARFs in the process of crown-root formation. For future analysis of the spatial distribution of ARF transcripts in crown tissue, in situ PCR protocol was improved and further optimization steps were proposed. In the next part, a candidate for the main inhibitor of crown-roots in barley was determined. Constructs for the CRISPR-Cas9-mediated knock-out of the candidate HvARF13 gene were prepared. By the method of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of barley immature embryos, six transgenic plants were obtained. Mutation in HvARF13 sequence was confirmed in one plant. Altogether, results presented in this thesis will help to further characterize the role of ARFs in barley.
Klíčová slova
nodální kořeny, Hordeum vulgare L., ARF, auxin
Klíčová slova v angličtině
crown-roots, Hordeum vulgare L., ARF, auxin
Rozsah průvodní práce
87 s. (161 649 znaků)
Jazyk
AN
Anotace
AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) proteiny představují velkou rodinu transkripčních faktorů, jejichž funkcí je aktivace nebo represe genů primární odpovědi na auxin. ARF jako součást auxinové signální dráhy regulují mnoho vývojových procesů rostlin. Byla studována role ARF proteinů v procesu zakládání a vývoje nodálních kořenů v ječmenu. V této práci bylo identifikováno 21 ARF proteinů v ječmenu, z nichž 8 ARF byla predikována funkce aktivátorů a 13 funkce represorů. Byla vytvořena teplotní mapa exprese ARF, která ukazuje, že většina ARF genů je exprimována napříč různými pletivy ječmene a úroveň jejich exprese se mění během vývoje. U ARF represorů byly pozorovány změny v expresních profilech během raného vývoje báze stonku, které naznačují roli těchto ARF v procesu tvorby nodálních kořenů. Pro budoucí analýzu prostorového rozložení ARF transkriptů v bázi stonku byl zdokonalen protokol in situ PCR a byly navrženy další kroky pro optimalizaci této metody. V následující části práce byl určen kandidátní ARF na funkci hlavního inhibitoru nodálních kořenů v ječmenu. Byly připraveny konstrukty pro vypnutí kandidátního genu HvARF13 pomocí CRISPR-Cas9. Metodou transformace nezralých embryí ječmene pomocí Agrobacterium tumefaciens bylo získáno 6 transgenních rostlin. Mutace v sekvenci HvARF13 byla potvrzena u jedné rostliny. Výsledky prezentované v této práci pomohou dále charakterizovat roli ARF v ječmenu.
Anotace v angličtině
AUXIN RESPONSE FACTORs (ARFs) represent a large family of transcription factors, that function as either activators or repressors of the early auxin-responsive genes. As a part of the auxin signaling pathway, ARFs regulate many developmental processes in plants. The role of ARFs in the process of crown-root initiation and development in barley was studied. In this work, 21 ARF proteins were identified in barley. From these, 8 ARFs were predicted to act as activators and 13 as repressors. A heat-map of ARF expression was generated, showing that most ARF genes are expressed among different barley tissues and the level of their expression varies during development. Focusing on the ARF repressors, changes in the expression profiles during the early crown development were observed, suggesting a role of these ARFs in the process of crown-root formation. For future analysis of the spatial distribution of ARF transcripts in crown tissue, in situ PCR protocol was improved and further optimization steps were proposed. In the next part, a candidate for the main inhibitor of crown-roots in barley was determined. Constructs for the CRISPR-Cas9-mediated knock-out of the candidate HvARF13 gene were prepared. By the method of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of barley immature embryos, six transgenic plants were obtained. Mutation in HvARF13 sequence was confirmed in one plant. Altogether, results presented in this thesis will help to further characterize the role of ARFs in barley.
Klíčová slova
nodální kořeny, Hordeum vulgare L., ARF, auxin
Klíčová slova v angličtině
crown-roots, Hordeum vulgare L., ARF, auxin
Zásady pro vypracování
In the theoretical part, the student will understand how the crown-roots of monocots initiate and develop. The student will try to establish a parallel between the crown-roots of monocots and the adventitious roots of Arabidopsis, both being shoot-derived organs. The student will determine the role of hormones, especially auxin and a specific group of transcription factors belonging to the auxin response factor (ARF) family.
The goal of the thesis is to identify the ARFs in barley and to focus on a potential repressor of crown-root initiation and development. For this purpose, the student will find barley sequences orthologs to known Arabidopsis and rice ARFs. Based on sequence alignment and comparison, the student will be able to obtain a phylogenetic tree from which the potential function will be hypothesized for barley ARFs. ARF with a predicted repressor functions will be further analyzed by qPCR for their expression in different tissues of barley plant, as well as during the crown-root initiation and development. The one with the best probability to play a role during this process will be knocked-out by CRISPR-Cas9 guided RNA and Agrobacterium-mediated plant transformation. The material obtained will be most probably analyzed after the duration of the master thesis.
Tools/methodologies used: MEGA7 for phylogeny, Primer3Plus for designing primers for qPCR and in situ PCR, DESKGEN to design gRNA for CRISPR-Cas9 guided RNA mediated knock-out, Agrobacterium-mediated barley transformation, qPCR for gene expression analysis, in situ PCR for cellular localization.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
In the theoretical part, the student will understand how the crown-roots of monocots initiate and develop. The student will try to establish a parallel between the crown-roots of monocots and the adventitious roots of Arabidopsis, both being shoot-derived organs. The student will determine the role of hormones, especially auxin and a specific group of transcription factors belonging to the auxin response factor (ARF) family.
The goal of the thesis is to identify the ARFs in barley and to focus on a potential repressor of crown-root initiation and development. For this purpose, the student will find barley sequences orthologs to known Arabidopsis and rice ARFs. Based on sequence alignment and comparison, the student will be able to obtain a phylogenetic tree from which the potential function will be hypothesized for barley ARFs. ARF with a predicted repressor functions will be further analyzed by qPCR for their expression in different tissues of barley plant, as well as during the crown-root initiation and development. The one with the best probability to play a role during this process will be knocked-out by CRISPR-Cas9 guided RNA and Agrobacterium-mediated plant transformation. The material obtained will be most probably analyzed after the duration of the master thesis.
Tools/methodologies used: MEGA7 for phylogeny, Primer3Plus for designing primers for qPCR and in situ PCR, DESKGEN to design gRNA for CRISPR-Cas9 guided RNA mediated knock-out, Agrobacterium-mediated barley transformation, qPCR for gene expression analysis, in situ PCR for cellular localization.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
Coudert et al. (2010): Genetic control of root development in rice, the model cereal. Trends in Plant Science 15: 219-226.
Mai et al. (2014): Genes controlling root development in rice. Rice 7: 30.
Da Costa et al. (2013): When stress and development go hand in hand: main hormonal controls of adventitious rooting in cuttings. Frontiers in Plant Science 4: 133.
Gutierrez et al. (2009): Phenotypic plasticity of adventitious rooting in Arabidopsis is controlled by complex regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR Transcripts and MicroRNA abundance. The Plant Cell 21: 3119-3132.
Chandler J.W. (2016): Auxin Response Factors. Plant, Cell and Environment 39: 1014-1028.
Seznam doporučené literatury
Coudert et al. (2010): Genetic control of root development in rice, the model cereal. Trends in Plant Science 15: 219-226.
Mai et al. (2014): Genes controlling root development in rice. Rice 7: 30.
Da Costa et al. (2013): When stress and development go hand in hand: main hormonal controls of adventitious rooting in cuttings. Frontiers in Plant Science 4: 133.
Gutierrez et al. (2009): Phenotypic plasticity of adventitious rooting in Arabidopsis is controlled by complex regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR Transcripts and MicroRNA abundance. The Plant Cell 21: 3119-3132.
Chandler J.W. (2016): Auxin Response Factors. Plant, Cell and Environment 39: 1014-1028.
Přílohy volně vložené
1 CD ROM
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, Dr.Sc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Doc. Komis: V práci byla studována celá řada ARF transkripčních faktorů. Jsou jejich aktivace zapojeny do stejných signalizačních drah? Je úroveň jejich aktivace závislá od síly stimulujícího faktoru? Kde přesně v struktuře proteinu je lokalizována doména pro dimerizaci? Je schopnost aktivace represorů závislá od jejich monomerické formy? Může mít v procese aktivace některých transkripčních faktorů význam jejich schopnost tvořit heterotetramery?
Prof. Šamaj: Dá se určit, které podskupiny ARF transkripčních faktorů mohou mýt význam v procesu tvorby nodálních kořenů a dá se předpokládat redundance jejich funkcí v případě jednoduchých mutantů?
Dr. Krasylenko: Na základě jakých kritérií byl pro studium vybrán HvARF13, proč nebyl vybrán HvARF14?