Předmětem předkládané diplomové práce bylo studium změn TCR repertoáru u pacientů s metastazujicím karcinomem ledviny a maligním melanomem léčených anti-PD1 protilátkou nivolumabem. Nivolumab selektivně blokuje interakci mezi PD-1 receptorem a jeho ligandem PD-L1 a umožňuje restartovat imunitní reakci proti nádorovýcm buňkám. Cílem práce bylo stanovení zastoupení jednotlivých V rodin TCR repertoáru u pacientů a porovnání s kontrolními vzorky zdravých dárců. Pro experimentální část práce byla využita metoda průtokové cytometrie s přímo značenými protilátkami anti-CD3 Pacific Blue, anti-CD4 APC/Cy7, anti-CD8 APC a anti-TCR (FITC a PE). Výsledná data byla podrobena statistické analýze za využití neparametrického Wilcoxonova testu a analýzy hlavních komponent s grafickým znázorněním. Výsledky ukázaly, že u pacientů je složení V rodin značně odlišné než u kontrolní skupiny. Byly zaznamenány vyznámné změny v následujících TCR rodinách (p<0.001): snížení CD4+ V 17, CD8+ V5.1, V5.3, V 7.1 a V 22, zvýšení CD4+ V 16 a V20. Výsledky také ukázaly odlišné chování určitých V rodin (CD4+ V 7.1, V4, V5.1 a V22) u pacientů s karcinomem ledviny oproti pacientům s melanomem. V případě rodiny CD4+ V21.3 byl pozorován významný nárůst u pacientů s karcinomem ledviny, zatímco u pacientů s melanomem byl pozorován významný úbytek stejné V rodiny. Na základě těchto výsledků jsme došli k následujícím závěrům: 1) Byly zaznamenány změny TCR repertoáru u pacientů s karcinomem ledviny a maligním melanomem lečených nivolumabem. 2) Nivolumab indukuje proliferaci specifických klonotypů V rodin. 3) Nárůst klonotypů V rodin pravděpodobně souvisí s terapeutickou odpovědí na léčbu.
Anotace v angličtině
The object of this thesis was to study the changes of TCR repertoire in patients with metastatic renal cell carcinoma and malignant melanoma treated with anti-PD1 antibody nivolumab. Nivolumab selectively blocks the interaction between the PD-1 receptor and its ligand PD-L1 and enables to restart the immune response against cancer cells. The aim of the study was to determine the proportion of individual V families of TCR repertoire in patients and to compare them with healthy donor controls. For the experimental part flow cytometry was used, with directly labeled antibodies anti-CD3 Pacific Blue, anti-CD4 APC / Cy7, anti-CD8 APC and anti-TCR (FITC and PE). The resulting data were subjected to statistical analysis using a non-parametric Wilcoxon test and principal component analysis with resulting plot. The results showed that the composition of V families is significantly different in patients than in the control group. Significant changes in following TCR families (p<0.001) were confirmed: decrease of CD4+ V 17, CD8+ V5.1, V5.3, V 7.1 and V 22, increase of CD4+ V 16 and V20. The results also showed different behavior of certain V families (CD4+ V 7.1, V4, V5.1 a V22) for renal cell carcinoma patients versus melanoma patients. In the case of the CD4+ V21.3 family, a significant increase was observed in patients with renal cell carcinoma, while a significant decrease in the same V family was observed in melanoma patients. Based on these results, we came to the following conclusions: 1) Changes in TCR repertoire were observed in patients with renal cell carcinoma and melanoma treated with nivolumab. 2) Nivolumab induces proliferation of specific V family clonotypes. 3) The increase in clonotypes of V families is probably related to the therapeutic response to treatment.
Předmětem předkládané diplomové práce bylo studium změn TCR repertoáru u pacientů s metastazujicím karcinomem ledviny a maligním melanomem léčených anti-PD1 protilátkou nivolumabem. Nivolumab selektivně blokuje interakci mezi PD-1 receptorem a jeho ligandem PD-L1 a umožňuje restartovat imunitní reakci proti nádorovýcm buňkám. Cílem práce bylo stanovení zastoupení jednotlivých V rodin TCR repertoáru u pacientů a porovnání s kontrolními vzorky zdravých dárců. Pro experimentální část práce byla využita metoda průtokové cytometrie s přímo značenými protilátkami anti-CD3 Pacific Blue, anti-CD4 APC/Cy7, anti-CD8 APC a anti-TCR (FITC a PE). Výsledná data byla podrobena statistické analýze za využití neparametrického Wilcoxonova testu a analýzy hlavních komponent s grafickým znázorněním. Výsledky ukázaly, že u pacientů je složení V rodin značně odlišné než u kontrolní skupiny. Byly zaznamenány vyznámné změny v následujících TCR rodinách (p<0.001): snížení CD4+ V 17, CD8+ V5.1, V5.3, V 7.1 a V 22, zvýšení CD4+ V 16 a V20. Výsledky také ukázaly odlišné chování určitých V rodin (CD4+ V 7.1, V4, V5.1 a V22) u pacientů s karcinomem ledviny oproti pacientům s melanomem. V případě rodiny CD4+ V21.3 byl pozorován významný nárůst u pacientů s karcinomem ledviny, zatímco u pacientů s melanomem byl pozorován významný úbytek stejné V rodiny. Na základě těchto výsledků jsme došli k následujícím závěrům: 1) Byly zaznamenány změny TCR repertoáru u pacientů s karcinomem ledviny a maligním melanomem lečených nivolumabem. 2) Nivolumab indukuje proliferaci specifických klonotypů V rodin. 3) Nárůst klonotypů V rodin pravděpodobně souvisí s terapeutickou odpovědí na léčbu.
Anotace v angličtině
The object of this thesis was to study the changes of TCR repertoire in patients with metastatic renal cell carcinoma and malignant melanoma treated with anti-PD1 antibody nivolumab. Nivolumab selectively blocks the interaction between the PD-1 receptor and its ligand PD-L1 and enables to restart the immune response against cancer cells. The aim of the study was to determine the proportion of individual V families of TCR repertoire in patients and to compare them with healthy donor controls. For the experimental part flow cytometry was used, with directly labeled antibodies anti-CD3 Pacific Blue, anti-CD4 APC / Cy7, anti-CD8 APC and anti-TCR (FITC and PE). The resulting data were subjected to statistical analysis using a non-parametric Wilcoxon test and principal component analysis with resulting plot. The results showed that the composition of V families is significantly different in patients than in the control group. Significant changes in following TCR families (p<0.001) were confirmed: decrease of CD4+ V 17, CD8+ V5.1, V5.3, V 7.1 and V 22, increase of CD4+ V 16 and V20. The results also showed different behavior of certain V families (CD4+ V 7.1, V4, V5.1 a V22) for renal cell carcinoma patients versus melanoma patients. In the case of the CD4+ V21.3 family, a significant increase was observed in patients with renal cell carcinoma, while a significant decrease in the same V family was observed in melanoma patients. Based on these results, we came to the following conclusions: 1) Changes in TCR repertoire were observed in patients with renal cell carcinoma and melanoma treated with nivolumab. 2) Nivolumab induces proliferation of specific V family clonotypes. 3) The increase in clonotypes of V families is probably related to the therapeutic response to treatment.
Cílem práce bude rozšíření znalostí v oblasti základního onkologického výzkumu souvisejícího s mechanismem účinku nových léčiv (nivolumab), check point inhibitorů (PD1, CTLA-4). Seznámení se s metodami vědecké práce, formulací otázek a designem experimentů, rešerší literatury, prací v laboratoři i publikováním a presentací výsledků. V rámci teoretické části práce bude vypracována rešerše zaměřená na současné trendy imunoterapie s využitím nových nových léčiv, zejména Nivolumab. V rámci praktické části bude stanoven TCR repertoár. Výsledky budou softwarově zpracovány a graficky znázorněny.
1)Vypracovat stručný přehled problematiky nových léčiv (Nivolumab), checkpoint ihibitorů (PD1, CTLA-4) využívaných k léčení karcinomu ledvin a maligního melanomu.
2)Důkladně se seznámit s metodikami přípravy a zpracování vzorků, s analýzou připravených vzorků metodou průtokové cytometrie.
3)Stanovit TCR repertoár.
4)Vyhodnotit naměřené výsledky a diskutovat je v porovnání s literaturou
5)Sepsat diplomovou práci.
Zásady pro vypracování
Cílem práce bude rozšíření znalostí v oblasti základního onkologického výzkumu souvisejícího s mechanismem účinku nových léčiv (nivolumab), check point inhibitorů (PD1, CTLA-4). Seznámení se s metodami vědecké práce, formulací otázek a designem experimentů, rešerší literatury, prací v laboratoři i publikováním a presentací výsledků. V rámci teoretické části práce bude vypracována rešerše zaměřená na současné trendy imunoterapie s využitím nových nových léčiv, zejména Nivolumab. V rámci praktické části bude stanoven TCR repertoár. Výsledky budou softwarově zpracovány a graficky znázorněny.
1)Vypracovat stručný přehled problematiky nových léčiv (Nivolumab), checkpoint ihibitorů (PD1, CTLA-4) využívaných k léčení karcinomu ledvin a maligního melanomu.
2)Důkladně se seznámit s metodikami přípravy a zpracování vzorků, s analýzou připravených vzorků metodou průtokové cytometrie.
3)Stanovit TCR repertoár.
4)Vyhodnotit naměřené výsledky a diskutovat je v porovnání s literaturou
5)Sepsat diplomovou práci.
Seznam doporučené literatury
1. Hodi F, O'Day S, McDermott D, Weber R, Sosman J, Haanen J, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010;363(8):711-23. 2. Hannani D, Locher C, Yamazaki T, Colin-Minard V, Vetizou M, Aymeric L, et al. Contribution of humoral immune responses to the antitumor effects mediated by anthracyclines. Cell death and differentiation. 2014;21:50-8. 3. Park S, Jiang Z, Mortenson ED, Deng L, Radkevich-Brown O, Yang X, et al. The therapeutic effect of anti-HER2/neu antibody depends on both innate and adaptive immunity. Cancer Cell. 2010;18:160-70.
4. Markovic S, Erickson L, Rao R et al. Malignant melanoma in the 21st century, part 1: epidemiology, risk factors, screening, prevention and diagnosis. Mayo Clin Proc. 2007;82:365-380.
5. Siegel R, Miller K et Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018;68: 7-30.
Seznam doporučené literatury
1. Hodi F, O'Day S, McDermott D, Weber R, Sosman J, Haanen J, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010;363(8):711-23. 2. Hannani D, Locher C, Yamazaki T, Colin-Minard V, Vetizou M, Aymeric L, et al. Contribution of humoral immune responses to the antitumor effects mediated by anthracyclines. Cell death and differentiation. 2014;21:50-8. 3. Park S, Jiang Z, Mortenson ED, Deng L, Radkevich-Brown O, Yang X, et al. The therapeutic effect of anti-HER2/neu antibody depends on both innate and adaptive immunity. Cancer Cell. 2010;18:160-70.
4. Markovic S, Erickson L, Rao R et al. Malignant melanoma in the 21st century, part 1: epidemiology, risk factors, screening, prevention and diagnosis. Mayo Clin Proc. 2007;82:365-380.
5. Siegel R, Miller K et Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin. 2018;68: 7-30.