Porozumenie procesom zodpovedných za vznik určitého typu poškodenia DNA predstavuje dôležitý krok pre možnosť štúdia reparačných mechanizmov, ktoré toto poškodenie opravujú. Jedným z obzvlášť toxických poškodení je DNA-proteínová väzba. Toto poškodenie je charakteristické vznikom stabilnej väzby medzi DNA a proteínom. Takýmto proteínom môže byť akýkoľvek proteín v blízkosti DNA, napríklad: histónové proteíny alebo enzýmy. Hlavným cieľom tejto bakalárskej práce bolo vytvorenie rastlinných systémov, pomocou ktorých bolo možné vizualizovať vplyv cytidínového analógu zebularínu na tvorbu DNA-proteínovej väzby. Navrhutie týchto rastlinných systémov sa opieralo o výsledky prác, kde autori študovali efekt zebularínu a iných cytidínových analógov na rastlinné alebo živočíšne systémy. V jednej z takých prác autori preukázali, že zebularín ovplyvňuje DNA METYLTRANSFERÁZU 1 a indukuje tak vznik DNA-proteínovej väzby. Tento efekt zebularínu bol v navrhnutých systémoch, ktoré obsahovali DNA METYLTRANSFERÁZU 1 fúzovanú s červeným fluorescenčným proteínom, vizualizovaný metódou konfokálnej mikroskopie s rotujúcim diskom. Po úspešnej vizualizácii efektu zebularínu bol otestovaný jeho vplyv na tvorbu pozorovaného efektu u deficientného mutanta v géne ŠTRUKTÚRNEJ ÚDRŽBY CHROMOZÓMOV 6B. Kvantifikáciou a štatistickým vyhodnotením získaných dát sa podarilo preukázať špecifický efekt zebularínu na pripravené reportérové, kombinované a mutantné línie Arabidopsis thaliana. Mutácia v géne ŠTRUKTÚRNEJ ÚDRŽBY CHROMOZÓMOV 6B vedie k zmene dynamiky pozorovaného efektu po vystavení zebularínu.
Anotace v angličtině
Understanding of the processes responsible for certain types of DNA damage is an important step in the process of studying the repair mechanisms that repair this damage. One of the particularly toxic damages is DNA-protein crosslink. This damage is characterized by the formation of a stable bond between DNA and protein. Such a protein can be any protein in the vicinity of DNA, for example histone proteins or enzymes. The main goal of this bachelor thesis was to create plant systems that could be used to visualize the effect of the cytidine analog zebularin on the formation of DNA-protein crosslink. The design of these plant systems was based on the results of works, where the authors studied the effect of zebularin and other cytidine analogues on plant or animal systems. In one such work, the authors demonstrated that zebularin affects DNA METYLTRANSFERASE 1 and thus induces the formation of DNA-protein crosslink. This effect of zebularin was visualized by spinnig-disk confocal microscopy in the proposed systems, which contained METYLTRANSFERASE 1 DNA fused to a red fluorescent protein. After successful visualization of the effect of zebularine, its effect on the formation of the observed effect in a deficient mutant in the STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOME 6B was tested. By quantification and statistical evaluation of the obtained data, we were able to demonstrate the specific effect of zebularine on the prepared reporter, combined and mutant Arabidopsis thaliana lines. A mutation in the STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOME 6B gene leads to a change in the dynamics of the observed effect after zebularin treatment.
Klíčová slova
DNA-proteínová väzba, zebularín, SMC5/6 komplex, konfokálna mikroskopia s rotujúcim diskom
Porozumenie procesom zodpovedných za vznik určitého typu poškodenia DNA predstavuje dôležitý krok pre možnosť štúdia reparačných mechanizmov, ktoré toto poškodenie opravujú. Jedným z obzvlášť toxických poškodení je DNA-proteínová väzba. Toto poškodenie je charakteristické vznikom stabilnej väzby medzi DNA a proteínom. Takýmto proteínom môže byť akýkoľvek proteín v blízkosti DNA, napríklad: histónové proteíny alebo enzýmy. Hlavným cieľom tejto bakalárskej práce bolo vytvorenie rastlinných systémov, pomocou ktorých bolo možné vizualizovať vplyv cytidínového analógu zebularínu na tvorbu DNA-proteínovej väzby. Navrhutie týchto rastlinných systémov sa opieralo o výsledky prác, kde autori študovali efekt zebularínu a iných cytidínových analógov na rastlinné alebo živočíšne systémy. V jednej z takých prác autori preukázali, že zebularín ovplyvňuje DNA METYLTRANSFERÁZU 1 a indukuje tak vznik DNA-proteínovej väzby. Tento efekt zebularínu bol v navrhnutých systémoch, ktoré obsahovali DNA METYLTRANSFERÁZU 1 fúzovanú s červeným fluorescenčným proteínom, vizualizovaný metódou konfokálnej mikroskopie s rotujúcim diskom. Po úspešnej vizualizácii efektu zebularínu bol otestovaný jeho vplyv na tvorbu pozorovaného efektu u deficientného mutanta v géne ŠTRUKTÚRNEJ ÚDRŽBY CHROMOZÓMOV 6B. Kvantifikáciou a štatistickým vyhodnotením získaných dát sa podarilo preukázať špecifický efekt zebularínu na pripravené reportérové, kombinované a mutantné línie Arabidopsis thaliana. Mutácia v géne ŠTRUKTÚRNEJ ÚDRŽBY CHROMOZÓMOV 6B vedie k zmene dynamiky pozorovaného efektu po vystavení zebularínu.
Anotace v angličtině
Understanding of the processes responsible for certain types of DNA damage is an important step in the process of studying the repair mechanisms that repair this damage. One of the particularly toxic damages is DNA-protein crosslink. This damage is characterized by the formation of a stable bond between DNA and protein. Such a protein can be any protein in the vicinity of DNA, for example histone proteins or enzymes. The main goal of this bachelor thesis was to create plant systems that could be used to visualize the effect of the cytidine analog zebularin on the formation of DNA-protein crosslink. The design of these plant systems was based on the results of works, where the authors studied the effect of zebularin and other cytidine analogues on plant or animal systems. In one such work, the authors demonstrated that zebularin affects DNA METYLTRANSFERASE 1 and thus induces the formation of DNA-protein crosslink. This effect of zebularin was visualized by spinnig-disk confocal microscopy in the proposed systems, which contained METYLTRANSFERASE 1 DNA fused to a red fluorescent protein. After successful visualization of the effect of zebularine, its effect on the formation of the observed effect in a deficient mutant in the STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOME 6B was tested. By quantification and statistical evaluation of the obtained data, we were able to demonstrate the specific effect of zebularine on the prepared reporter, combined and mutant Arabidopsis thaliana lines. A mutation in the STRUCTURAL MAINTENANCE OF CHROMOSOME 6B gene leads to a change in the dynamics of the observed effect after zebularin treatment.
Klíčová slova
DNA-proteínová väzba, zebularín, SMC5/6 komplex, konfokálna mikroskopia s rotujúcim diskom
1. Zpracování literární rešerše na téma tvorby kovalentních DNA-proteinových vazeb a jejich oprav v eukaryotických buňkách.
2. Příprava a selekce mutantních, reportérových a kombinovaných rostlinných linií.
3. Analýza fenotypů selektovaných linií po chemickém působení indukčním činidlem pomocí konfokální mikroskopie.
4. Zvládnutí molekulárně biologických metod týkajících se přípravy a analýzy systému.
Zásady pro vypracování
1. Zpracování literární rešerše na téma tvorby kovalentních DNA-proteinových vazeb a jejich oprav v eukaryotických buňkách.
2. Příprava a selekce mutantních, reportérových a kombinovaných rostlinných linií.
3. Analýza fenotypů selektovaných linií po chemickém působení indukčním činidlem pomocí konfokální mikroskopie.
4. Zvládnutí molekulárně biologických metod týkajících se přípravy a analýzy systému.
Seznam doporučené literatury
1. Stingele, J., Bellelli, R., Alte, F., Hewitt, G., Sarek, G., Maslen, S.L., Tsutakawa, S.E., Borg, A., Kjaer, S., Tainer, J.A., Skehel, J.M., Groll, M., Boulton, S.J., 2016. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Mol Cell 64: 688 - 703.
2. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S.J., 2017. Mechanisms of DNA protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol 18: 563 - 573.
3. Liu, C.H., Finke, A., Díaz, M., Rozhon, W., Poppenberger, B., Baubec, T., Pecinka, A., 2015. Repair of DNA Damage Induced by the Cytidine Analog Zebularine Requires ATR and ATM in Arabidopsis. Plant Cell 27: 1788 - 1800.
4. Tretyakova, N.Y., Groehler, A., Ji, S., 2015. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Acc Chem Res 48: 1631 - 1644
5. Schermelleh, L., Haemmer, A., Spada, F., Rösing, N., Meilinger, D., Rothbauer, U., Cardoso, M.C., Leonhardt, H., 2007. Dynamics of Dnmt1 interaction with the replication machinery and its role in postreplicative maintenance of DNA methylation. Nucleic Acids Res 35: 4301 - 4312.
Seznam doporučené literatury
1. Stingele, J., Bellelli, R., Alte, F., Hewitt, G., Sarek, G., Maslen, S.L., Tsutakawa, S.E., Borg, A., Kjaer, S., Tainer, J.A., Skehel, J.M., Groll, M., Boulton, S.J., 2016. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Mol Cell 64: 688 - 703.
2. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S.J., 2017. Mechanisms of DNA protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol 18: 563 - 573.
3. Liu, C.H., Finke, A., Díaz, M., Rozhon, W., Poppenberger, B., Baubec, T., Pecinka, A., 2015. Repair of DNA Damage Induced by the Cytidine Analog Zebularine Requires ATR and ATM in Arabidopsis. Plant Cell 27: 1788 - 1800.
4. Tretyakova, N.Y., Groehler, A., Ji, S., 2015. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Acc Chem Res 48: 1631 - 1644
5. Schermelleh, L., Haemmer, A., Spada, F., Rösing, N., Meilinger, D., Rothbauer, U., Cardoso, M.C., Leonhardt, H., 2007. Dynamics of Dnmt1 interaction with the replication machinery and its role in postreplicative maintenance of DNA methylation. Nucleic Acids Res 35: 4301 - 4312.
Přílohy volně vložené
CD ROM
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu bakalářské práce studenta Jaroslava Fiľa zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Student seznámil komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce Mgr. Aleše Pečinky, Ph.D. a v zastoupení posudku oponentky Mgr. Olgy Šamajové, Dr.
Student pak reagoval na připomínky a dotazy.
Prezentace studenta obsahovala tato témata:
- Poškození DNA
- Zebularin, cytidinový analog a jeho účinky, cytotoxicita
- Design experimentu, selekce experimentálních rostlin
- Studium účinku zebularinu, indukce poškození DNA u huseníčku
- Mutace SMC6B a její vliv na dynamiku tvorby MET1 ohnisek pomocí MET1-RFP
- Lokalizace markerů PCNA1-GFP v buňkách
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Mechanismus, kterým ppd. poškozuje zebularin DNA
- Navození nárůstu v indukci MET1-RFP foci zvýšením koncentrace zebularinu u specifického mutanta; pravděpodobnost indukce buněčné smrti buněk kořenů testovaných rostlin
- Statistické hodnocení výsledků pomocí Studentova t-testu
- Geny reparačních drah, BRCA1 gen u rostlin
- Znaky sledované při studiu účinku zebularinu
- Markery použité k selekci experimentálních rostlin, experimentálních lnií
- Hodnocení kolokalizace signálů v buňkách
Student na dotazy položené oponentkou práce a členy komise reagoval pohotově, věcně, se zjevnou znalostí problematiky.