Mykoplazmy jsou nejmenší prokaryotické buňky, které jsou schopny infikovat téměř všechny buněčné linie. Mykoplazmové infekce vedou k celé řadě změn v buněčných liniích
a představují tak hlavní problém v technice buněčných kultur. K detekci rané fáze infekce, kdy je kontaminace mykoplazmy velmi nízká nebo za situace, kdy je potlačen růst mykoplazmy (ošetření buněčných kultur antibiotiky) je vyžadována vysoká citlivost detekčních metod. PCR patří mezi běžně používané molekulárně biologické metody k detekci mykoplazmové infekce buněčných kultur. Metoda PCR je poměrně nákladná a vyžaduje náročné přístrojové vybavení,
a proto není vhodná pro analýzu v terénu. V poslední době dochází k rozvoji izotermálních amplifikačních technik, které mají oproti PCR řadu výhod. Jednou z těchto metod je Rekombinázová polymerázová reakce, RPA, která se díky vysoké specificitě a rychlosti používá k identifikaci nejrůznějších patogenů.
Cílem teoretické části této diplomové práce bylo za použití uvedené literatury popsat charakteristiku mykoplazmy, shrnout vybrané metody detekce mykoplazmy v buněčných kulturách, popsat princip metody RPA, její výhody/nevýhody ve srovnání s metodou PCR a její použití.
Cílem experimentální části diplomové práce byl vývoj a validace typizační soupravy TwistAmp? exo k detekci mykoplazmy pomocí RPA.
Bylo zjištěno, že detekční limit metody RPA je stejný jako v případě metody real-time PCR, tj. 60 molekul syntetického standardu M. arginini na 1 ?l. Na základě výsledků této práce má metoda RPA vysoký potenciál k tomu, stát se alternativou metody real-time PCR k detekci mykoplazmové infekce v buněčných linií, i přes svoji odlišnou dynamiku. Pro získání CE-IVD značky bude potřeba provést ještě několik testů k dokončení validace této typizační soupravy.
Anotace v angličtině
Mycoplasmas are the smallest prokaryotic cells which are able to infect almost all of the cell lines. Mycoplasma infections lead to the various changes of cell lines and they represent the main issue in the cell culture techniques. For a detection of the early phase of infection when the contamination of mycoplasma is very low or in a situation when the growth of the mycoplasma is repressed (antibiotic treatment of cell cultures), the high-sensitivity detection methods are required. PCR is one of the commonly used molecular biology methods for a detection
of mycoplasma infection of cell cultures. PCR method is relatively expensive and requires demanding instrument, therefore it is not suitable for a field analysis. Recently we can observe the development of the isothermal amplification technologies which have, in comparison with PCR, many benefits. One of these methods is a Recombinase polymerase reaction, RPA, which is used for an identification of various pathogens thanks to the high specificity and speed.
The aim of the theoretical part of this diploma thesis was to describe the characteristics of mycoplasma, to summarize the selected methods of mycoplasma detection in cell cultures, to describe the principle of the RPA method, its advantages and disadvantages in comparison with PCR method and its application, using the listed literature.
The aim of the experimental part of the diploma thesis was to develop and validate the typing kits TwistAmp? exo for a detection of mycoplasma using RPA.
It was ascertained that a detection limit of RPA method is the same as real-time PCR method, i.e. 60 molecules of M. arginini synthetic standard per 1 ?l. Based on the results of this thesis, the RPA method has a huge potential to become an alternative to the real-time PCR method for a detection of mycoplasma infection in cell lines, despite the different dynamics.
For the acquisition of the CE-IVD certification it will be necessary to execute a few more field test to complete the validation of these typing kits.
Mykoplazmy jsou nejmenší prokaryotické buňky, které jsou schopny infikovat téměř všechny buněčné linie. Mykoplazmové infekce vedou k celé řadě změn v buněčných liniích
a představují tak hlavní problém v technice buněčných kultur. K detekci rané fáze infekce, kdy je kontaminace mykoplazmy velmi nízká nebo za situace, kdy je potlačen růst mykoplazmy (ošetření buněčných kultur antibiotiky) je vyžadována vysoká citlivost detekčních metod. PCR patří mezi běžně používané molekulárně biologické metody k detekci mykoplazmové infekce buněčných kultur. Metoda PCR je poměrně nákladná a vyžaduje náročné přístrojové vybavení,
a proto není vhodná pro analýzu v terénu. V poslední době dochází k rozvoji izotermálních amplifikačních technik, které mají oproti PCR řadu výhod. Jednou z těchto metod je Rekombinázová polymerázová reakce, RPA, která se díky vysoké specificitě a rychlosti používá k identifikaci nejrůznějších patogenů.
Cílem teoretické části této diplomové práce bylo za použití uvedené literatury popsat charakteristiku mykoplazmy, shrnout vybrané metody detekce mykoplazmy v buněčných kulturách, popsat princip metody RPA, její výhody/nevýhody ve srovnání s metodou PCR a její použití.
Cílem experimentální části diplomové práce byl vývoj a validace typizační soupravy TwistAmp? exo k detekci mykoplazmy pomocí RPA.
Bylo zjištěno, že detekční limit metody RPA je stejný jako v případě metody real-time PCR, tj. 60 molekul syntetického standardu M. arginini na 1 ?l. Na základě výsledků této práce má metoda RPA vysoký potenciál k tomu, stát se alternativou metody real-time PCR k detekci mykoplazmové infekce v buněčných linií, i přes svoji odlišnou dynamiku. Pro získání CE-IVD značky bude potřeba provést ještě několik testů k dokončení validace této typizační soupravy.
Anotace v angličtině
Mycoplasmas are the smallest prokaryotic cells which are able to infect almost all of the cell lines. Mycoplasma infections lead to the various changes of cell lines and they represent the main issue in the cell culture techniques. For a detection of the early phase of infection when the contamination of mycoplasma is very low or in a situation when the growth of the mycoplasma is repressed (antibiotic treatment of cell cultures), the high-sensitivity detection methods are required. PCR is one of the commonly used molecular biology methods for a detection
of mycoplasma infection of cell cultures. PCR method is relatively expensive and requires demanding instrument, therefore it is not suitable for a field analysis. Recently we can observe the development of the isothermal amplification technologies which have, in comparison with PCR, many benefits. One of these methods is a Recombinase polymerase reaction, RPA, which is used for an identification of various pathogens thanks to the high specificity and speed.
The aim of the theoretical part of this diploma thesis was to describe the characteristics of mycoplasma, to summarize the selected methods of mycoplasma detection in cell cultures, to describe the principle of the RPA method, its advantages and disadvantages in comparison with PCR method and its application, using the listed literature.
The aim of the experimental part of the diploma thesis was to develop and validate the typing kits TwistAmp? exo for a detection of mycoplasma using RPA.
It was ascertained that a detection limit of RPA method is the same as real-time PCR method, i.e. 60 molecules of M. arginini synthetic standard per 1 ?l. Based on the results of this thesis, the RPA method has a huge potential to become an alternative to the real-time PCR method for a detection of mycoplasma infection in cell lines, despite the different dynamics.
For the acquisition of the CE-IVD certification it will be necessary to execute a few more field test to complete the validation of these typing kits.
Vypracováním teoretické části diplomové práce student prokáže schopnost orientovat se v tématech protinádorové biomedicíny, pracovat s odbornými cizojazyčnými texty a řádně citovat. V praktické části student prokáže schopnost samostatně naplánovat, provést a vyhodnotit laboratorní experiment. 1. Sepsat rešerši o metodách detekce mykoplazmy a o metodě RPA, o jejím principu/výhodách/nevýhodách ve srovnání s metodou PCR, o jejím použití.
2. Podílet se na vývoji a validaci typizační soupravy k detekci mykoplazmy pomocí RPA
Zásady pro vypracování
Vypracováním teoretické části diplomové práce student prokáže schopnost orientovat se v tématech protinádorové biomedicíny, pracovat s odbornými cizojazyčnými texty a řádně citovat. V praktické části student prokáže schopnost samostatně naplánovat, provést a vyhodnotit laboratorní experiment. 1. Sepsat rešerši o metodách detekce mykoplazmy a o metodě RPA, o jejím principu/výhodách/nevýhodách ve srovnání s metodou PCR, o jejím použití.
2. Podílet se na vývoji a validaci typizační soupravy k detekci mykoplazmy pomocí RPA
Seznam doporučené literatury
1. ABD EL, Wahed A., EL-DEEB, A., EL-THOLOTH, M., ABD EL, Kader H., AHMED, A., HASSAN, S., HOFFMANN, B., HAAS, B., SHALABY, M. A., HUFERT, F. T. a WEIDMANN, M. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PLoS ONE, 2013, 8(8), e71642-1932-6203 (Electronic).PM:23977101 2. DAHER, R. K., STEWART, G., BOISSINOT, M. a BERGERON, M. G. Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications. Clinical Chemistry, 2016, 62(7), 947-958. 1530-8561 (Electronic).PM:27160000 3. DAHER, R. K., STEWART, G., BOISSINOT, M., BOUDREAU, D. K. a BERGERON, M. G. Influence of sequence mismatches on the specificity of recombinase polymerase amplification technology. Molecular and Cellular Probes, 2015, 29(2), 116-121. PM:25481659 4. EULER, M., WANG, Y., HEIDENREICH, D., PATEL, P., STROHMEIER, O., HAKENBERG, S., NIEDRIG, M., HUFERT, F. T. a WEIDMANN, M. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. J Clin.Microbiol., 2013, 51(4), 1110-1117. 1098-660X (Electronic).PM:23345286 5. KERSTING, S., RAUSCH, V., BIER, F. F. a VON NICKISCH-ROSENEGK, M. Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens. Mikrochim.Acta, 2014, 181(13-14), 1715-1723. 0026-3672 (Print).PM:25253912 6. PIEPENBURG, O., WILLIAMS, C. H., STEMPLE, D. L. a ARMES, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology, 2006, 4(7), 1115-1121. 1544-9173.ISI:000238974300005 7. ROHRMAN, B. a RICHARDS-KORTUM, R. Inhibition of recombinase polymerase amplification by background DNA: a lateral flow-based method for enriching target DNA. Analytical Chemistry, 2015, 87(3), 1963-1967. PM:25560368 8. ROHRMAN, B. A. a RICHARDS-KORTUM, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on A Chip, 2012, 12(17), 3082-3088. PM:22733333
Seznam doporučené literatury
1. ABD EL, Wahed A., EL-DEEB, A., EL-THOLOTH, M., ABD EL, Kader H., AHMED, A., HASSAN, S., HOFFMANN, B., HAAS, B., SHALABY, M. A., HUFERT, F. T. a WEIDMANN, M. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PLoS ONE, 2013, 8(8), e71642-1932-6203 (Electronic).PM:23977101 2. DAHER, R. K., STEWART, G., BOISSINOT, M. a BERGERON, M. G. Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications. Clinical Chemistry, 2016, 62(7), 947-958. 1530-8561 (Electronic).PM:27160000 3. DAHER, R. K., STEWART, G., BOISSINOT, M., BOUDREAU, D. K. a BERGERON, M. G. Influence of sequence mismatches on the specificity of recombinase polymerase amplification technology. Molecular and Cellular Probes, 2015, 29(2), 116-121. PM:25481659 4. EULER, M., WANG, Y., HEIDENREICH, D., PATEL, P., STROHMEIER, O., HAKENBERG, S., NIEDRIG, M., HUFERT, F. T. a WEIDMANN, M. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. J Clin.Microbiol., 2013, 51(4), 1110-1117. 1098-660X (Electronic).PM:23345286 5. KERSTING, S., RAUSCH, V., BIER, F. F. a VON NICKISCH-ROSENEGK, M. Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens. Mikrochim.Acta, 2014, 181(13-14), 1715-1723. 0026-3672 (Print).PM:25253912 6. PIEPENBURG, O., WILLIAMS, C. H., STEMPLE, D. L. a ARMES, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology, 2006, 4(7), 1115-1121. 1544-9173.ISI:000238974300005 7. ROHRMAN, B. a RICHARDS-KORTUM, R. Inhibition of recombinase polymerase amplification by background DNA: a lateral flow-based method for enriching target DNA. Analytical Chemistry, 2015, 87(3), 1963-1967. PM:25560368 8. ROHRMAN, B. A. a RICHARDS-KORTUM, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on A Chip, 2012, 12(17), 3082-3088. PM:22733333
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Veroniky Vaňkové zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce.
Následovalo přečtení posudku vedoucího práce prof. Mgr. Jiřího Drábka, Ph.D. a oponentky Mgr. Jany Stránské, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- Mykoplazmové infekce, kontaminace buněčných kultur
- Metody detekce mykoplazem
- Rekombinázová polymerázová amplifikační reakce
- Navržení primerů a sond vhodných pro RPA, příprava syntetických standardů
- Ověření funkčnosti navrženého systému RPA pro detekci mykoplazem
- Srovnání RPA a Q-PCR, spolehlivost a detekční limit
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Seznam zkratek doplnit o méně běžné zkratky
- Použití převážně primárních zdrojů, necitovat studentské práce nebo laboratorní webové manuály
- Tvar křivek syntetického standardu - příčiny rozdílů
- Teplota tání amplikonu, rozlišení primerových dimerů a specifických produktů
- Využití RPA při detekci živočišných virů - existence a dostupnost komerčních kitů v detekci Covid19
- Postup detekce mykoplazem v médium, podstata komerčně dostupných testů
- Možnost přímé detekce mykoplazem v lyzátu bez izolace DNA
- Finanční náročnost, porovnání komerčních kitů a laboratorních postupů
Studentka na dotazy položené oponentkou práce a členy komise reagovala pohotově, věcně, se znalostí problematiky.