Tato diplomová práce se zaměřuje na produkci a purifikaci rekombinantního monoklonálního imunoglobulinu za použití eukaryotního expresního systému. Teoretická část této práce se věnuje patogenezi IgA nefropatie, imunoglobulinům a jejich glykosylaci, tvorbě imunokomplexů a možnostem terapie. Použitým expresním systémem byla suspenzní buněčná linie HEK 293F. Byla provedena optimalizace transfekce této buněčné linie plazmidy pro lehký a těžký řetězec IgG. Po transfekci byla provedena optimalizace purifikace rekombinantního IgG a následně byla protilátka charakterizována pomocí ELISA testu. Tato diplomová práce představila metodu produkce rekombinantní velmi specifické molekuly IgG, jejíž sekvence byla získaná od pacienta trpícího IgA nefropatií. Tento rekombinantní protein (IgG 1123) by následně mohl pomoct ve vývoji terapeutického postupu.
Anotace v angličtině
This thesis focuses on the production and purification of recombinant monoclonal immunoglobulin using a eukaryotic expression system. The theoretical part of this work deals with the pathogenesis of IgA nephropathy, immunoglobulins and their glycosylation, formation of immunocomplexes and possibilities of therapy. The expression system used was the HEK 293F suspension cell line. The transfection of this cell line with plasmids for the light and heavy chains of IgG was optimized. After transfection, recombinant IgG purification was optimized and the antibody was characterized by ELISA. This thesis presented a method of producing a recombinant very specific IgG molecule, whose sequence was obtained from a patient suffering from IgA nephropathy. This recombinant protein (IgG 1123) could subsequently assist in the development of a therapeutic procedure.
Klíčová slova
IgA nefropatie, glykoproteiny, rekombinantní proteiny, transfekce
Klíčová slova v angličtině
IgA nephropathy, glycoproteins, recombinant proteins, transfection
Rozsah průvodní práce
59
Jazyk
CZ
Anotace
Tato diplomová práce se zaměřuje na produkci a purifikaci rekombinantního monoklonálního imunoglobulinu za použití eukaryotního expresního systému. Teoretická část této práce se věnuje patogenezi IgA nefropatie, imunoglobulinům a jejich glykosylaci, tvorbě imunokomplexů a možnostem terapie. Použitým expresním systémem byla suspenzní buněčná linie HEK 293F. Byla provedena optimalizace transfekce této buněčné linie plazmidy pro lehký a těžký řetězec IgG. Po transfekci byla provedena optimalizace purifikace rekombinantního IgG a následně byla protilátka charakterizována pomocí ELISA testu. Tato diplomová práce představila metodu produkce rekombinantní velmi specifické molekuly IgG, jejíž sekvence byla získaná od pacienta trpícího IgA nefropatií. Tento rekombinantní protein (IgG 1123) by následně mohl pomoct ve vývoji terapeutického postupu.
Anotace v angličtině
This thesis focuses on the production and purification of recombinant monoclonal immunoglobulin using a eukaryotic expression system. The theoretical part of this work deals with the pathogenesis of IgA nephropathy, immunoglobulins and their glycosylation, formation of immunocomplexes and possibilities of therapy. The expression system used was the HEK 293F suspension cell line. The transfection of this cell line with plasmids for the light and heavy chains of IgG was optimized. After transfection, recombinant IgG purification was optimized and the antibody was characterized by ELISA. This thesis presented a method of producing a recombinant very specific IgG molecule, whose sequence was obtained from a patient suffering from IgA nephropathy. This recombinant protein (IgG 1123) could subsequently assist in the development of a therapeutic procedure.
Klíčová slova
IgA nefropatie, glykoproteiny, rekombinantní proteiny, transfekce
Klíčová slova v angličtině
IgA nephropathy, glycoproteins, recombinant proteins, transfection
Zásady pro vypracování
1. Vypracování literární rešerše zaměřené na význam protilátek v patogenezi IgA nefropatie.
2. Praktická část zaměřena na optimalizaci metody kotransfekce buněk HEK 293F plazmidy pro lehký a těžký imunoglobulinový řetězec.
3. Optimalizace purifikace produktů za využití afinitní chromatografie.
4. Charakterizace produktů- koncentrace, čistota, vazba antigenu.
Zásady pro vypracování
1. Vypracování literární rešerše zaměřené na význam protilátek v patogenezi IgA nefropatie.
2. Praktická část zaměřena na optimalizaci metody kotransfekce buněk HEK 293F plazmidy pro lehký a těžký imunoglobulinový řetězec.
3. Optimalizace purifikace produktů za využití afinitní chromatografie.
4. Charakterizace produktů- koncentrace, čistota, vazba antigenu.
Seznam doporučené literatury
Mestecky J, Raska M. (2012) IgA nephropathy: Molecular mechanisms of the disease. The annual review of pathology: Mechanisms of disease. 8:217-40
Tomana M, Novak J, Julian B. (1999)Circulating immune complexes in IgA nephropathy
consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies. The journal of clinical investigativní. Volume 4. Number 1.
Mestecky J, Tomana M. (2008) Role of Aberrant Glycosylation of IgA1 Molecules in the Pathogenesis of IgA Nephropathy. Kidney blood press. 31:29-37
Seznam doporučené literatury
Mestecky J, Raska M. (2012) IgA nephropathy: Molecular mechanisms of the disease. The annual review of pathology: Mechanisms of disease. 8:217-40
Tomana M, Novak J, Julian B. (1999)Circulating immune complexes in IgA nephropathy
consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies. The journal of clinical investigativní. Volume 4. Number 1.
Mestecky J, Tomana M. (2008) Role of Aberrant Glycosylation of IgA1 Molecules in the Pathogenesis of IgA Nephropathy. Kidney blood press. 31:29-37
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Terézie Kurové zahájil prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce.
Následovalo přečtení posudku vedoucího práce Mgr. Michala Křupky, Ph.D. a oponenta Mgr. Petra Kosztyu, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- IgA nefropatie - charakteristika, projevy, diagnóza
- Patogeneze IgA nefropatie
- Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Mezangium - struktura, charakteristika, funkce
- ELISA s IgA kontrolou
- Spojitost infekcí horních cest dýchacích s IgA nefropatií
- Řídící faktor v ELISA experimentu
- Odhad výtěžku IgA autoprotilátky z purifikace
- Přibližné množství polymerního IgG v reakci ELISA experimentu
- Charakteristika použitých buněk v experimentech
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala pohotově, věcně a přiměřeně.