Arginasa je manganoenzym, který katalyzuje hydrolytický rozklad L-argininu na ornithin a močovinu. U rostlin bylo zjištěno, že hraje důležitou dvojí roli ve vývoji rostlin. První role je v průběhu klíčení rostlin, kdy se aktivita arginasy zvyšuje. Další důležitou roli hraje arginasa při dozrávání plodů. Během působení stresových faktorů dochází k indukci exprese arginasy a předpokládá se, že arginasa je zapojena do odpovědi rostlin na stres. Tato diplomová práce byla v teoretické části zaměřena na dostupné poznatky o rostlinných arginasách včetně metod stanovení aktivity. Dále byly stručně charakterizovány dostupné poznatky o lokalizaci a produkci oxidu dusnatého u rostlin a znalosti o funkcích a metabolismu polyaminů u rostlin. V experimentální části byla jako modelová rostlina použita semena hrachu setého (Pisum sativum cv. Abarth), ze které byla izolována mitochondriální frakce. Byl sledován vývoj aktivity arginasy v průběhu klíčení a při pěstování za různých světelných podmínek (střídání světla a tmy a tma). Dále byl sledován vliv zamražení mitochondriální frakce a následného rozmražení na aktivitu arginasy. Rovněž se sledovala teplotní stabilita při různých teplotách a dobách aktivace. Byla stanovena hodnota Michaelisovy konstanty (66 mmol?l-1). V dalších experimentech byl zhodnocen vliv modifikačních činidel, ze kterých vyplývá, že se v blízkosti aktivního místa nachází cystein. V přítomnosti inhibitoru arginasy norvalinu v Hoagladově roztoku nebyly histochemicky zaznamenány změny v produkci oxidu dusnatého. Srovnáním sekvencí rostlinných arginas s genomem hrachu a provedenou nativní elektroforézou s následným barvením se lze domnívat, že u hrachu setého se nachází jediný protein s arginasovou aktivitou.
Anotace v angličtině
Arginase is a manganese-containing enzyme, which catalyzes the hydrolysis of L-arginine to ornithine and urea. In plants, arginase plays two important roles in development. The first role is during germination where the activity of arginase is increasing. Another important role of arginase was described during fruit development. During stress conditions, arginase expression is induced and it is assumed that arginase is involved in plant stress responses. This diploma thesis was in theoretical part focused on available knowledge of plant arginases including methods of activity measurement. Knowledge of localization and production of nitric oxide in plants and knowledge of functions and metabolism of plant polyamines was also characterized. In experimental part were used pea (Pisum sativum cv. Abarth) seeds were used as a model organism to isolate mitochondrial fraction. Changes in the specific activity of arginase were observed during germination and growth under different light conditions (alternation of light and dark and dark). Impact of freezing and thawing of mitochondrial fraction was examined and also the impact of different temperatures and time of activation. Value of Michaelis constant was determined (66 mmol?l-1). In the next experiments the impact of modifying reagents on activity of the arginase was evaluated. From results it can be concluded that a cystein residue is located near the enzyme active site. Histochemical production of nitric oxide in lateral roots was not affected by the presence of arginase inhibitor norvaline. From comparing plant sequences with the pea genome and native electrophoresis with subsequent staining we can assume that pea contains one protein with arginase activity.
Arginasa je manganoenzym, který katalyzuje hydrolytický rozklad L-argininu na ornithin a močovinu. U rostlin bylo zjištěno, že hraje důležitou dvojí roli ve vývoji rostlin. První role je v průběhu klíčení rostlin, kdy se aktivita arginasy zvyšuje. Další důležitou roli hraje arginasa při dozrávání plodů. Během působení stresových faktorů dochází k indukci exprese arginasy a předpokládá se, že arginasa je zapojena do odpovědi rostlin na stres. Tato diplomová práce byla v teoretické části zaměřena na dostupné poznatky o rostlinných arginasách včetně metod stanovení aktivity. Dále byly stručně charakterizovány dostupné poznatky o lokalizaci a produkci oxidu dusnatého u rostlin a znalosti o funkcích a metabolismu polyaminů u rostlin. V experimentální části byla jako modelová rostlina použita semena hrachu setého (Pisum sativum cv. Abarth), ze které byla izolována mitochondriální frakce. Byl sledován vývoj aktivity arginasy v průběhu klíčení a při pěstování za různých světelných podmínek (střídání světla a tmy a tma). Dále byl sledován vliv zamražení mitochondriální frakce a následného rozmražení na aktivitu arginasy. Rovněž se sledovala teplotní stabilita při různých teplotách a dobách aktivace. Byla stanovena hodnota Michaelisovy konstanty (66 mmol?l-1). V dalších experimentech byl zhodnocen vliv modifikačních činidel, ze kterých vyplývá, že se v blízkosti aktivního místa nachází cystein. V přítomnosti inhibitoru arginasy norvalinu v Hoagladově roztoku nebyly histochemicky zaznamenány změny v produkci oxidu dusnatého. Srovnáním sekvencí rostlinných arginas s genomem hrachu a provedenou nativní elektroforézou s následným barvením se lze domnívat, že u hrachu setého se nachází jediný protein s arginasovou aktivitou.
Anotace v angličtině
Arginase is a manganese-containing enzyme, which catalyzes the hydrolysis of L-arginine to ornithine and urea. In plants, arginase plays two important roles in development. The first role is during germination where the activity of arginase is increasing. Another important role of arginase was described during fruit development. During stress conditions, arginase expression is induced and it is assumed that arginase is involved in plant stress responses. This diploma thesis was in theoretical part focused on available knowledge of plant arginases including methods of activity measurement. Knowledge of localization and production of nitric oxide in plants and knowledge of functions and metabolism of plant polyamines was also characterized. In experimental part were used pea (Pisum sativum cv. Abarth) seeds were used as a model organism to isolate mitochondrial fraction. Changes in the specific activity of arginase were observed during germination and growth under different light conditions (alternation of light and dark and dark). Impact of freezing and thawing of mitochondrial fraction was examined and also the impact of different temperatures and time of activation. Value of Michaelis constant was determined (66 mmol?l-1). In the next experiments the impact of modifying reagents on activity of the arginase was evaluated. From results it can be concluded that a cystein residue is located near the enzyme active site. Histochemical production of nitric oxide in lateral roots was not affected by the presence of arginase inhibitor norvaline. From comparing plant sequences with the pea genome and native electrophoresis with subsequent staining we can assume that pea contains one protein with arginase activity.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o úloze arginasy v metabolismu dusíkatých látek u živočichů a rostlin, se zaměřením na funkci arginasy v metabolismu polyaminů v rostlinách a jejich odpovědích na abiotické a biotické stresové podmínky
Testování a optimalizace metody stanovení aktivity a hladiny arginasy v rostlinných vzorcích
Studium změny aktivity arginasy ve vzorcích rostlin vystavených modelovým stresovým podmínkám
Zásady pro vypracování
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o úloze arginasy v metabolismu dusíkatých látek u živočichů a rostlin, se zaměřením na funkci arginasy v metabolismu polyaminů v rostlinách a jejich odpovědích na abiotické a biotické stresové podmínky
Testování a optimalizace metody stanovení aktivity a hladiny arginasy v rostlinných vzorcích
Studium změny aktivity arginasy ve vzorcích rostlin vystavených modelovým stresovým podmínkám
Seznam doporučené literatury
Chen, H et al. (2004) Regulation of plant arginase by wounding, jasmonate, and the phytotoxin coronatine. Journal of Biological Chemistry 279: 45998-46007
Flores T et al. (2008) Arginase-negative mutants of Arabidopsis exhibit increased nitric oxide signaling in root development. Plant Physiol. 147:1936-46.
Groß F et al. (2017) Copper amine oxidase 8 regulates arginine-dependent nitric oxide production in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 68: 2149-2162
Shi HT and Chan ZL (2013) In vivo role of Arabidopsis arginase in arginine metabolism and abiotic stress response. Plant Signaling & Behavior 8:5, e24138
Seznam doporučené literatury
Chen, H et al. (2004) Regulation of plant arginase by wounding, jasmonate, and the phytotoxin coronatine. Journal of Biological Chemistry 279: 45998-46007
Flores T et al. (2008) Arginase-negative mutants of Arabidopsis exhibit increased nitric oxide signaling in root development. Plant Physiol. 147:1936-46.
Groß F et al. (2017) Copper amine oxidase 8 regulates arginine-dependent nitric oxide production in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 68: 2149-2162
Shi HT and Chan ZL (2013) In vivo role of Arabidopsis arginase in arginine metabolism and abiotic stress response. Plant Signaling & Behavior 8:5, e24138
Přílohy volně vložené
1 CD-ROM
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Úloha arginasy v signálních drahách oxidu dusnatého a polyaminů v stresových odpovědích rostlin student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Student zodpověděl dotazy položené v posudku oponenta. Odpověděl také na dotazy členů zkušební komise:
doc. Tarkowski: Proč měly mutantní rostliny vyšší výnosy? O jaké zvýšení se jednalo? Na základě čeho byla provedena frakcionace? Můžete to prosím blíže vysvětlit? Máte příklad enzymu, kde by se aktivita výrazně změnila po zmražení?
doc. Luhová: Jak lze prokázat, že máte jen mitochondriální či membránovou frakci?