Organické acidémie jsou velkou skupinou dědičných metabolických poruch, které způsobují akumulaci organických kyselin v tělních tekutinách, narušují tak acidobazickou rovnováhu a vedou k progresivní encefalopatii. Současná analýza organických kyselin se provádí pomocí GC-MS, která ale trpí určitými nedostatky, mezi které patří především časová náročnost a potřeba většího množství vzorku. V teoretické části této práce jsou zpracovány dosavadní poznatky o organických acidémiích, možnostech jejich diagnostiky a současný stav analýzy organických kyselin.
V praktické části byla provedena optimalizace LC-MS metody, byla ověřena linearita odezvy a byly také vypočítány LOD a LOQ všech metabolitů. Byla stanovena stabilita vybraných oxokyselin za různých teplot skladování a byla provedena analýza vzorků močí pro laboratorní diagnostiku DMP.
Metoda bylo optimalizována pro 151 metabolitů pokrývající velmi širokou škálu organických acidémií, bylo možné také jednoznačně identifikovat veškeré izomery. Jako nejvhodnější teplota pro skladování vzorků močí z hlediska stability oxokyselin se obecně jeví teplota -80 °C, naopak pro skladování vodných roztoků standardů +4 °C. Analýzou vzorků močí nově vyvinutou LC-MS metodou se podařilo diagnostikovat pacienty s methylmalonovu acidémií, leucinózou, glutarovou acidurií typu I
a ß-ketothiolasovou deficiencí.
Annotation in English
Organic acidemias are a big group of inborn errors of metabolism that cause an accumulation of organic acids in body fluids which disrupts acid-base balance leading to progressive encephalopathy. Current organic acids analysis is provided by GS-MS, which is however time-consuming and requires a larger amount of sample. In the theoretical part of this thesis is processed current knowledge of organic acidemias, their diagnostic options and current state of organic acids analysis.
In the experimental part the LC-MS method was optimized, the linearity of the response was verified and the LOD and LOQ of all metabolites were also calculated. The stability of selected oxoacids at different storage temperatures was determined and urine samples were analysed for laboratory diagnosis of IEM.
The method was optimized for 151 metabolites covering a very wide range of organic acidemias, it was also possible to unambiguously identify all isomers. The most suitable temperature for the storage of urine samples for oxoacid stability appears to be in general -80 °C, vice versa for the storage of aqueous solutions standards +4 °C. Analysis of urine samples by the newly developed LC-MS method managed to diagnose patients with methylmalonic acidemia, maple syrup urine disease, glutaric aciduria type I and ß- ketothiolase deficiency.
Inherited metabolic disorders, organic acidemias, liquid chromatography, mass spectrometry
Length of the covering note
142 s. (179 000 znaků)
Language
CZ
Annotation
Organické acidémie jsou velkou skupinou dědičných metabolických poruch, které způsobují akumulaci organických kyselin v tělních tekutinách, narušují tak acidobazickou rovnováhu a vedou k progresivní encefalopatii. Současná analýza organických kyselin se provádí pomocí GC-MS, která ale trpí určitými nedostatky, mezi které patří především časová náročnost a potřeba většího množství vzorku. V teoretické části této práce jsou zpracovány dosavadní poznatky o organických acidémiích, možnostech jejich diagnostiky a současný stav analýzy organických kyselin.
V praktické části byla provedena optimalizace LC-MS metody, byla ověřena linearita odezvy a byly také vypočítány LOD a LOQ všech metabolitů. Byla stanovena stabilita vybraných oxokyselin za různých teplot skladování a byla provedena analýza vzorků močí pro laboratorní diagnostiku DMP.
Metoda bylo optimalizována pro 151 metabolitů pokrývající velmi širokou škálu organických acidémií, bylo možné také jednoznačně identifikovat veškeré izomery. Jako nejvhodnější teplota pro skladování vzorků močí z hlediska stability oxokyselin se obecně jeví teplota -80 °C, naopak pro skladování vodných roztoků standardů +4 °C. Analýzou vzorků močí nově vyvinutou LC-MS metodou se podařilo diagnostikovat pacienty s methylmalonovu acidémií, leucinózou, glutarovou acidurií typu I
a ß-ketothiolasovou deficiencí.
Annotation in English
Organic acidemias are a big group of inborn errors of metabolism that cause an accumulation of organic acids in body fluids which disrupts acid-base balance leading to progressive encephalopathy. Current organic acids analysis is provided by GS-MS, which is however time-consuming and requires a larger amount of sample. In the theoretical part of this thesis is processed current knowledge of organic acidemias, their diagnostic options and current state of organic acids analysis.
In the experimental part the LC-MS method was optimized, the linearity of the response was verified and the LOD and LOQ of all metabolites were also calculated. The stability of selected oxoacids at different storage temperatures was determined and urine samples were analysed for laboratory diagnosis of IEM.
The method was optimized for 151 metabolites covering a very wide range of organic acidemias, it was also possible to unambiguously identify all isomers. The most suitable temperature for the storage of urine samples for oxoacid stability appears to be in general -80 °C, vice versa for the storage of aqueous solutions standards +4 °C. Analysis of urine samples by the newly developed LC-MS method managed to diagnose patients with methylmalonic acidemia, maple syrup urine disease, glutaric aciduria type I and ß- ketothiolase deficiency.
Inherited metabolic disorders, organic acidemias, liquid chromatography, mass spectrometry
Research Plan
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
-Zpracování literární rešerše shrnující dostupné poznatky o dědičných metabolických poruchách se zaměřením na organické acidémie a jejich laboratorní diagnostiku
-Shrnutí aktuálního stavu analýzy organických kyselin pro diagnostiku dědičných metabolických poruch a studium cíleného metabolomického přístupu v klinické oblasti
-Klinická cílená metabolomická analýza biologických materiálů (např. moč, sérum, plasma, buněčné linie) zaměřená na komplexní skupinu organických kyselin metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií na principu trojitého kvadrupólu
-Příprava biologických vzorků pro diagnostiku dědičných metabolických poruch (organických acidémií), jejich analýza nově vyvinutou metodou viz výše, kvantitativní vyhodnocení naměřených dat a interpretace výsledků
Research Plan
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Vzhledem k nouzovému stavu platnému v době odevzdání závěrečných prací ve školním roce 2019/2020 je student povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Dva svázané výtisky obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce student odevzdá přímo zkušební komisy v den obhajoby.
-Zpracování literární rešerše shrnující dostupné poznatky o dědičných metabolických poruchách se zaměřením na organické acidémie a jejich laboratorní diagnostiku
-Shrnutí aktuálního stavu analýzy organických kyselin pro diagnostiku dědičných metabolických poruch a studium cíleného metabolomického přístupu v klinické oblasti
-Klinická cílená metabolomická analýza biologických materiálů (např. moč, sérum, plasma, buněčné linie) zaměřená na komplexní skupinu organických kyselin metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií na principu trojitého kvadrupólu
-Příprava biologických vzorků pro diagnostiku dědičných metabolických poruch (organických acidémií), jejich analýza nově vyvinutou metodou viz výše, kvantitativní vyhodnocení naměřených dat a interpretace výsledků
Recommended resources
Nenad Blau, Marinius Duran, K. Michael Gibson. Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics. Berlín : Springer, 2008.
Uttam Garg, Laurie D. Smith. Biomarkers in Inborn Errors of Metabolism, Clinical Aspects and Laboratory Determination: Elsevier, 2017.
Körver-Keularts, I. M. L. W. et al., (2018). Fast and accurate quantitative organic acid analysis with LC-QTOF/MS facilitates screening of patients for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease, 41(3), 415424. https://doi.org/10.1007/s10545-017-0129-0.
Tanaka, K. et al. (1966). Isovaleric acidemia: a new genetic defect of leucine metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 56(1), 236242.
Tanaka, K. et al. (1980). Gas-chromatographic method of analysis for urinary organic acids. II. Description of the procedure, and its application to diagnosis of patients with organic acidurias. Clinical Chemistry, 26, 1847-1853.
Recommended resources
Nenad Blau, Marinius Duran, K. Michael Gibson. Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics. Berlín : Springer, 2008.
Uttam Garg, Laurie D. Smith. Biomarkers in Inborn Errors of Metabolism, Clinical Aspects and Laboratory Determination: Elsevier, 2017.
Körver-Keularts, I. M. L. W. et al., (2018). Fast and accurate quantitative organic acid analysis with LC-QTOF/MS facilitates screening of patients for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease, 41(3), 415424. https://doi.org/10.1007/s10545-017-0129-0.
Tanaka, K. et al. (1966). Isovaleric acidemia: a new genetic defect of leucine metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 56(1), 236242.
Tanaka, K. et al. (1980). Gas-chromatographic method of analysis for urinary organic acids. II. Description of the procedure, and its application to diagnosis of patients with organic acidurias. Clinical Chemistry, 26, 1847-1853.
Enclosed appendices
-
Appendices bound in thesis
tables
Taken from the library
Yes
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce Multikomponentní analýza organických kyselin v biologických vzorcích pro laboratorní diagnostiku dědičných metabolických poruch studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten posudek vedoucího práce a oponentský posudek. Studentka zodpověděla dotazy položené v posudku vedoucího i oponenta. Odpověděla také na dotazy členů zkušební komise:
doc. Petřivalský: Je nějaká idea, jak zlepšit kvantifikaci oxokyselin? Zkoušeli jste jiné typy kolon?
dr. Danihlík: Proč jste použili statistické váhy 1/y pro kalibrační přímku? Jak metodicky komplikuje hodnota fyziologické koncentrace ve srovnání s patologickou koncentrací, která je často o řád i dva vyšší? Jak vznikl interval hodnot pro fyziologické koncentrace daných látek?