Cílem této diplomové práce je ověřit metodu panelového sekvenování genů pro detekci biomarkerů v diagnostických solidních nádorech. V teoretické části jsou diskutovány základní principy personalizované medicíny a role genomických biomarkerů v této léčebné strategii. Protože naše experimenty byly z velké míry prováděny na BRCA-mutovaných nádorech a chordomech, je zde popsána také cílená terapie pro tyto typy nádorů. Hlavní pozornost je však věnována srovnání různých přístupů sekvenační analýzy nádorového genomu, zejména s ohledem na uplatnění v klinické praxi.
Experimentální část je zaměřena na využitelnost panelu NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel, který pokrývá specifické regiony 50 genů. Ačkoli tato metoda prokázala schopnost detekovat většinu hledaných variant, nezachytila jeden z důležitých prediktivních biomarkerů odpovědi na anti-EGFR terapii. Na základě toho byl genový panel posouzen pro odlišné aplikace, jako je analýza chordomů. Protože metoda umožňuje začlenění UMI barkódů do sekvenačních čtení, bylo dalším záměrem experimentů otestovat přínosy tohoto přístupu. Pro zpracování sekvenačních dat se začleněnými UMI byla s pomocí otevřených programů sestavena bioinformatická analýza a výsledky byly porovnány s výstupy programu MiSeq Reporter Software. Analýza byla posléze úspěšně ověřena i pro další panel NEBNext Direct BRCA1/BRCA2.
Anotace v angličtině
The objective of this master's thesis is to evaluate a gene-panel sequencing method for detection of biomarkers in diagnostic solid tumours. In the theoretical part, the basic principles of personalized medicine and the role of genomic biomarkers in this treatment strategy are discussed. Targeted therapies for BRCA-mutated cancers and chordomas are also included, because the gene-panel testing in our experiments was performed mostly on these types of tumours. Nevertheless, the main attention is devoted to the comparison of different approaches for cancer genome sequencing analysis with respect to their utility in clinical practice.
The experimental part is focused on the applicability of NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel covering specific regions of 50 genes. Even though the method proved to be able to detect most of the desired variants, it missed one of the important predictive biomarkers for response to anti-EGFR therapy. Accordingly, the gene panel was considered for different applications such as analysis of chordomas. Since the method enables incorporation of UMI adapters into the sequencing reads, the next goal of the thesis was to explore benefits of this approach. For processing UMI-containing sequencing data, the pipeline using open-source software was created and results were compared with outputs from MiSeq Reporter Software. The pipeline was then successfully evaluated also for another panel NEBNext Direct BRCA1/BRCA2.
Cílem této diplomové práce je ověřit metodu panelového sekvenování genů pro detekci biomarkerů v diagnostických solidních nádorech. V teoretické části jsou diskutovány základní principy personalizované medicíny a role genomických biomarkerů v této léčebné strategii. Protože naše experimenty byly z velké míry prováděny na BRCA-mutovaných nádorech a chordomech, je zde popsána také cílená terapie pro tyto typy nádorů. Hlavní pozornost je však věnována srovnání různých přístupů sekvenační analýzy nádorového genomu, zejména s ohledem na uplatnění v klinické praxi.
Experimentální část je zaměřena na využitelnost panelu NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel, který pokrývá specifické regiony 50 genů. Ačkoli tato metoda prokázala schopnost detekovat většinu hledaných variant, nezachytila jeden z důležitých prediktivních biomarkerů odpovědi na anti-EGFR terapii. Na základě toho byl genový panel posouzen pro odlišné aplikace, jako je analýza chordomů. Protože metoda umožňuje začlenění UMI barkódů do sekvenačních čtení, bylo dalším záměrem experimentů otestovat přínosy tohoto přístupu. Pro zpracování sekvenačních dat se začleněnými UMI byla s pomocí otevřených programů sestavena bioinformatická analýza a výsledky byly porovnány s výstupy programu MiSeq Reporter Software. Analýza byla posléze úspěšně ověřena i pro další panel NEBNext Direct BRCA1/BRCA2.
Anotace v angličtině
The objective of this master's thesis is to evaluate a gene-panel sequencing method for detection of biomarkers in diagnostic solid tumours. In the theoretical part, the basic principles of personalized medicine and the role of genomic biomarkers in this treatment strategy are discussed. Targeted therapies for BRCA-mutated cancers and chordomas are also included, because the gene-panel testing in our experiments was performed mostly on these types of tumours. Nevertheless, the main attention is devoted to the comparison of different approaches for cancer genome sequencing analysis with respect to their utility in clinical practice.
The experimental part is focused on the applicability of NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel covering specific regions of 50 genes. Even though the method proved to be able to detect most of the desired variants, it missed one of the important predictive biomarkers for response to anti-EGFR therapy. Accordingly, the gene panel was considered for different applications such as analysis of chordomas. Since the method enables incorporation of UMI adapters into the sequencing reads, the next goal of the thesis was to explore benefits of this approach. For processing UMI-containing sequencing data, the pipeline using open-source software was created and results were compared with outputs from MiSeq Reporter Software. The pipeline was then successfully evaluated also for another panel NEBNext Direct BRCA1/BRCA2.
Vypracováním teoretické části diplomové práce student prokáže schopnost orientovat se v tématu prediktivního testování pro biologickou protinádorovou léčbu, pracovat s odbornými cizojazyčnými texty a řádně citovat.
V praktické části student prokáže schopnost samostatně naplánovat, provést, optimalizovat a vyhodnotit laboratorní experiment. Důraz je kladen na integraci nových technologií na bázi sekvenování panelu genů, který může změnit a vylepšit nynější způsob diagnostiky somatickým mutací solidních nádorů. Student ověří možnost použití masivně paralelního sekvenování pro analýzu tekuté biopsie. Student prokáže schopnost objektivně vyhodnotit dopady změn v technologii genotypizace.
Zásady pro vypracování
Vypracováním teoretické části diplomové práce student prokáže schopnost orientovat se v tématu prediktivního testování pro biologickou protinádorovou léčbu, pracovat s odbornými cizojazyčnými texty a řádně citovat.
V praktické části student prokáže schopnost samostatně naplánovat, provést, optimalizovat a vyhodnotit laboratorní experiment. Důraz je kladen na integraci nových technologií na bázi sekvenování panelu genů, který může změnit a vylepšit nynější způsob diagnostiky somatickým mutací solidních nádorů. Student ověří možnost použití masivně paralelního sekvenování pro analýzu tekuté biopsie. Student prokáže schopnost objektivně vyhodnotit dopady změn v technologii genotypizace.
Seznam doporučené literatury
Saito M et al. Gene aberrations for precision medicine against lung adenocarcinoma. Cancer Sci. 2016 Jun;107(6):713-20. doi: 10.1111/cas.12941. Epub 2016 May 25. Review. PubMed PMID: 27027665; PubMed Central PMCID: PMC4968599.
NEBNext Direct? Cancer HotSpot Panel Instruction Manual
https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7000.pdf
Kevin LeVan at al (Sept. 2016) NextGENe Software Analysis Using the NEBNext Direct? Cancer Hotspot Panel
Amanda J. Redig1 Clinical and Molecular Characteristics of NF1-Mutant Lung Cancer doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2377
Morgensztern D et al.. Molecularly targeted therapies in non-small-cell lung cancer annual update 2014. J Thorac Oncol. 2015 Jan;10(1 Suppl 1):S1-63. doi: 10.1097/JTO.0000000000000405. PubMed PMID: 25535693; PubMed
Central PMCID: PMC4346098. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/25535693/
Jotte RM, Spigel DR. Advances in molecular-based personalized non-small-cell lung cancer therapy: targeting epidermal growth factor receptor and mechanisms of resistance. Cancer Medicine. 2015;4(11):1621-1632. doi:10.1002/cam4.506.
Shao D et al .. A targeted next-generation sequencing method for identifying clinically relevant mutation profiles in lung adenocarcinoma. Sci Rep. 2016 Mar 3;6:22338. doi: 10.1038/srep22338. PubMed PMID: 26936516; PubMed Central PMCID: PMC4776238.
Seznam doporučené literatury
Saito M et al. Gene aberrations for precision medicine against lung adenocarcinoma. Cancer Sci. 2016 Jun;107(6):713-20. doi: 10.1111/cas.12941. Epub 2016 May 25. Review. PubMed PMID: 27027665; PubMed Central PMCID: PMC4968599.
NEBNext Direct? Cancer HotSpot Panel Instruction Manual
https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7000.pdf
Kevin LeVan at al (Sept. 2016) NextGENe Software Analysis Using the NEBNext Direct? Cancer Hotspot Panel
Amanda J. Redig1 Clinical and Molecular Characteristics of NF1-Mutant Lung Cancer doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2377
Morgensztern D et al.. Molecularly targeted therapies in non-small-cell lung cancer annual update 2014. J Thorac Oncol. 2015 Jan;10(1 Suppl 1):S1-63. doi: 10.1097/JTO.0000000000000405. PubMed PMID: 25535693; PubMed
Central PMCID: PMC4346098. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/25535693/
Jotte RM, Spigel DR. Advances in molecular-based personalized non-small-cell lung cancer therapy: targeting epidermal growth factor receptor and mechanisms of resistance. Cancer Medicine. 2015;4(11):1621-1632. doi:10.1002/cam4.506.
Shao D et al .. A targeted next-generation sequencing method for identifying clinically relevant mutation profiles in lung adenocarcinoma. Sci Rep. 2016 Mar 3;6:22338. doi: 10.1038/srep22338. PubMed PMID: 26936516; PubMed Central PMCID: PMC4776238.
Přílohy volně vložené
CD ROM
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Barbory Koblihové zahájil prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce Ing. Rastislava Slavkovského, Ph.D. a oponenta MUDr. Josefa Srovnala, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
- Personalizovaná medicína
- Biomarkery a jejich typy
- Sekvenování panelu genů
- Chordomy - výskyt, terapie, cílená léčiva
- Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
- Detekce strukturních aberací low-pass celogenomovým sekvenováním, limitace u somatických či germinálních variant, detekce LOH/AOH
- Detekce nádorů a její souvislost s hranicí pro podání léčby vzhledem k nádorové heterogenitě a jejich klonální evoluci
- Selhání panelu NEB Cancer při testování cfDNA
- Výhody NGC vs. ddPCR pro vyšetřování tekutých biopsií
- Původ chordomů
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala pohotově, věcně a přiměřeně.