Abstrakt
Vrstva epiteliálních buněk odděluje rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím hmyzu. Střevní epitel hmyzu hraje důležitou roli v mnoha procesech, které zahrnují výživu, imunitní reakce a osmoregulaci. V teoretické části této práce jsou zpracovány dostupné poznatky o složkách a funkci epiteliální imunity hmyzu se zaměřením na roli reaktivních forem kyslíku, oxidu dusnatého a antimikrobiálních peptidů, jakožto hlavních signálních a efektorových molekul.
V praktické části byly včelám extrahovány trávicí soustavy, které byly inkubovány s lipopolysacharidem a odebírány v různých časových intervalech. V extraktech těchto trávicích soustav byla následně stanovována specifická aktivita katalasy a superoxiddismutasy a koncentrace NO2-, jakožto jediného stabilního konečného produktu autooxidace NO ve vodném roztoku v nepřítomnosti hemoproteinů. Dále byla provedena mikroskopická detekce peroxidu vodíku, superoxidového anionradikálu a oxidu dusnatého bez inkubace a s inkubací s lipopolysacharidem. Peroxidu vodíku byl detekován pomocí 0,5% roztoku diaminobenzidinu, superoxidový anionradikál pomocí 2mM roztoku tetrazoliové modři a oxid dusnatý pomocí fluorescenční sondy DAF-FM diacetát. Byla provedena také tricinová elektroforéza extraktů vzorků trávicích soustav a imunochemická detekce antimikrobiálních peptidů defensinu a abaecinu po přenosu proteinů a peptidů na nitrocelulosovou membránu.
Specifická aktivita katalasy se při inkubaci s lipopolysacharidem v čase zvyšovala, nejvyšší byla po 18 hodinách. Specifická aktivita superoxiddismutasy vykazovala nejvyšší hodnoty po 8 hodinách inkubace s LPS. Nejvyšší koncentrace NO2- byla naměřena po 2 hodinách inkubace s LPS a postupně se snižovala. Mikroskopickou detekcí bylo potvrzeno, že při styku s bakteriemi nebo jejími složkami dochází ke zvýšené produkci H2O2, O2-- a NO. Pro vizualizaci proteinů na gelech se lépe osvědčil kit One-step Lumitein Protein Gel Stain. Imunochemická detekce defensinu a abaecinu nebyla úspěšná, pravděpodobně vzhledem k jejich nízké koncentraci v epiteliálních buňkách.
Annotation in English
Abstract
A layer of epithelial cells defines every interface between the inner world of the insect body and the outer world of the external environment. The insect gut epithelium plays an important role in multiple processes, including nutrition, immunity and osmoregulation. The theoretical part of this Bachelor's thesis describes available knowledge about components and functions of insect epithelial immunity focusing on the role of reactive oxygen species, nitric oxide and antimicrobial peptides as main signal and effector molecules.
In the practical part of the Bachelor's thesis honey bee digesticve tracts were removed and incubated with lipopolysachyride for different time intervals. In extracts of these digestive tracts catalase and superoxid dismutase specific activities, as well as NO2- concentration were determined. Nitrite is the main stable endproduct of the autoxidation of NO in aqueous solution in the absence of hemoproteins. The microscopic detection of hydrogen peroxide, superoxide anion radical and nitric oxide was performed without and with incubation with lipopolysacharide. Hydrogen peroxide was detected using 0,5% solution of diaminobenzidine, superoxide anion radical was detected using 2mM solution of nitro blue tetrazolium chloride and nitric oxide was detected using DAF-FM diacetate fluorescence probe. Tricine electrophoresis of digestive tract extracts and immunochemical detection of defensin and abaecin antimicrobial peptides after protein and peptide transfer to the nitrocellulose membrane were also tested.
Catalase specific activity increased after incubation with lipopolysaccharide over time, the highest activity was observed after 18 hours. Specific activity of superoxide dismutase showed the highest values after 8 hours of incubation with LPS. The highest nitrite concentration was measured after 2 hours of incubation with LPS and gradually decreased. Microscopic detection confirmed that contact with bacteria or its components results in increased production of H2O2, O2-- and NO. The One-step Lumitein Protein Gel Stain kit was proven better for visualizing proteins on electrophoretic gels. Immunochemical detection of defensin and abacine was not successfu, probably due to their low concentration in epithelial cells.
Abstrakt
Vrstva epiteliálních buněk odděluje rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím hmyzu. Střevní epitel hmyzu hraje důležitou roli v mnoha procesech, které zahrnují výživu, imunitní reakce a osmoregulaci. V teoretické části této práce jsou zpracovány dostupné poznatky o složkách a funkci epiteliální imunity hmyzu se zaměřením na roli reaktivních forem kyslíku, oxidu dusnatého a antimikrobiálních peptidů, jakožto hlavních signálních a efektorových molekul.
V praktické části byly včelám extrahovány trávicí soustavy, které byly inkubovány s lipopolysacharidem a odebírány v různých časových intervalech. V extraktech těchto trávicích soustav byla následně stanovována specifická aktivita katalasy a superoxiddismutasy a koncentrace NO2-, jakožto jediného stabilního konečného produktu autooxidace NO ve vodném roztoku v nepřítomnosti hemoproteinů. Dále byla provedena mikroskopická detekce peroxidu vodíku, superoxidového anionradikálu a oxidu dusnatého bez inkubace a s inkubací s lipopolysacharidem. Peroxidu vodíku byl detekován pomocí 0,5% roztoku diaminobenzidinu, superoxidový anionradikál pomocí 2mM roztoku tetrazoliové modři a oxid dusnatý pomocí fluorescenční sondy DAF-FM diacetát. Byla provedena také tricinová elektroforéza extraktů vzorků trávicích soustav a imunochemická detekce antimikrobiálních peptidů defensinu a abaecinu po přenosu proteinů a peptidů na nitrocelulosovou membránu.
Specifická aktivita katalasy se při inkubaci s lipopolysacharidem v čase zvyšovala, nejvyšší byla po 18 hodinách. Specifická aktivita superoxiddismutasy vykazovala nejvyšší hodnoty po 8 hodinách inkubace s LPS. Nejvyšší koncentrace NO2- byla naměřena po 2 hodinách inkubace s LPS a postupně se snižovala. Mikroskopickou detekcí bylo potvrzeno, že při styku s bakteriemi nebo jejími složkami dochází ke zvýšené produkci H2O2, O2-- a NO. Pro vizualizaci proteinů na gelech se lépe osvědčil kit One-step Lumitein Protein Gel Stain. Imunochemická detekce defensinu a abaecinu nebyla úspěšná, pravděpodobně vzhledem k jejich nízké koncentraci v epiteliálních buňkách.
Annotation in English
Abstract
A layer of epithelial cells defines every interface between the inner world of the insect body and the outer world of the external environment. The insect gut epithelium plays an important role in multiple processes, including nutrition, immunity and osmoregulation. The theoretical part of this Bachelor's thesis describes available knowledge about components and functions of insect epithelial immunity focusing on the role of reactive oxygen species, nitric oxide and antimicrobial peptides as main signal and effector molecules.
In the practical part of the Bachelor's thesis honey bee digesticve tracts were removed and incubated with lipopolysachyride for different time intervals. In extracts of these digestive tracts catalase and superoxid dismutase specific activities, as well as NO2- concentration were determined. Nitrite is the main stable endproduct of the autoxidation of NO in aqueous solution in the absence of hemoproteins. The microscopic detection of hydrogen peroxide, superoxide anion radical and nitric oxide was performed without and with incubation with lipopolysacharide. Hydrogen peroxide was detected using 0,5% solution of diaminobenzidine, superoxide anion radical was detected using 2mM solution of nitro blue tetrazolium chloride and nitric oxide was detected using DAF-FM diacetate fluorescence probe. Tricine electrophoresis of digestive tract extracts and immunochemical detection of defensin and abaecin antimicrobial peptides after protein and peptide transfer to the nitrocellulose membrane were also tested.
Catalase specific activity increased after incubation with lipopolysaccharide over time, the highest activity was observed after 18 hours. Specific activity of superoxide dismutase showed the highest values after 8 hours of incubation with LPS. The highest nitrite concentration was measured after 2 hours of incubation with LPS and gradually decreased. Microscopic detection confirmed that contact with bacteria or its components results in increased production of H2O2, O2-- and NO. The One-step Lumitein Protein Gel Stain kit was proven better for visualizing proteins on electrophoretic gels. Immunochemical detection of defensin and abacine was not successfu, probably due to their low concentration in epithelial cells.
- Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o složkách a funkci epiteliální imunity v trávicí soustavě hmyzu, se zaměřením na úlohu reaktivních forem kyslíku (ROS), oxid dusnatého (NO) a antimikrobiální peptidy (AMP) jako signálních a efektorových molekul.
- Zavedení metod detekce vybraných zástupců ROS, NO a AMP v střevech hmyzu.
- Studium změn vybraných parametrů epiteliální imunity po inkubaci trávicí soustavy dospělých včel s lipopolysacharidem v laboratorních podmínkách.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Research Plan
- Vypracovat literární rešerši shrnující dostupné poznatky o složkách a funkci epiteliální imunity v trávicí soustavě hmyzu, se zaměřením na úlohu reaktivních forem kyslíku (ROS), oxid dusnatého (NO) a antimikrobiální peptidy (AMP) jako signálních a efektorových molekul.
- Zavedení metod detekce vybraných zástupců ROS, NO a AMP v střevech hmyzu.
- Studium změn vybraných parametrů epiteliální imunity po inkubaci trávicí soustavy dospělých včel s lipopolysacharidem v laboratorních podmínkách.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Recommended resources
- Jefferson JM et al. (2013) Barrier immune effectors Are maintained during transition from nurse to forager in the Hhney Bee. PLoS ONE 8(1): e54097
- Ryu JH et al. (2010) Innate immunity and gutmicrobe mutualism in Drosophila. Developmental and Comparative Immunology 34: 369376
- Zhang L et al. (2015) Midgut immune responses induced by bacterial infection in the silkworm, Bombyx mori. Journal of Zhejiang University-Sci B (Biomed & Biotechnol) 16:875-882
Recommended resources
- Jefferson JM et al. (2013) Barrier immune effectors Are maintained during transition from nurse to forager in the Hhney Bee. PLoS ONE 8(1): e54097
- Ryu JH et al. (2010) Innate immunity and gutmicrobe mutualism in Drosophila. Developmental and Comparative Immunology 34: 369376
- Zhang L et al. (2015) Midgut immune responses induced by bacterial infection in the silkworm, Bombyx mori. Journal of Zhejiang University-Sci B (Biomed & Biotechnol) 16:875-882
Enclosed appendices
-
Appendices bound in thesis
-
Taken from the library
Yes
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího bakalářské práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
doc. Luhová: Může být včela ovlivněna před extrakcí trávicího traktu tak, že by došlo k ovlivnění experimentu?
prof. Frébort: Máte představu o koncentraci peptidů v tkáních včel?