Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací sterilních kultivačních podmínek u Medicago sativa. M. sativa je trvalá fialově kvetoucí rostlina, která dnes roste téměř po celém světě v mnoha různých biotypech. Vojtěška se především využívá jako krmivo a podsev při pěstování obilovin, ale i jako modelový organismus pro genetické studie. Kultivace Medicago sativa probíhá pomocí metody zvané somatická embryogeneze. Je to proces, při kterém se vyvíjejí embrya ze somatických buněk. Hlavním cílem této práce byla kultivace vojtěšky skrze somatickou embryogenezi s modifikacemi ve sterilizaci listů, složení jednotlivých médií i samotné délky kultivace. V rámci experimentu byly použity jak kontrolní rostliny, tak i transgenní rostliny M. sativa. Pro ověření, zda se během propagace rostlinného materiálu produkují rostliny se stejnou genetickou úpravou, jsme využili analytickou techniku zvanou Western blot. Během experimentu byla provedena fotodokumentace, která mapuje průběh celé kultivace. Zjistili jsme, že kontrolním rostlinám se více dařilo při kultivaci podle původního protokolu. Naopak u transgenních rostlin byla větší úspěšnost kultivace zaznamenána po úpravě původního protokolu. Z výsledků byl navržen optimální protokol pro možné budoucí kultivace M. sativa.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis deals with the optimization of the sterile cultivation conditions of Medicago sativa. M. sativa is a violet blossoming plant that grows almost all over the world in many different biotypes. Alfalfa is mainly used as a feed for animals and for better productivity of grain cultivation, but also as a model organism for genetic studies. Medicago sativa is cultivated using a method called somatic embryogenesis. It is a process in which embryos develop from somatic cells. The main goal of this work was the cultivation of alfalfa through somatic embryogenesis with various modifications, for example, sterilization of leaves, composition of individual media and the length of cultivation itself. The control plant and the transgenic plant of M. sativa were used in the experiment. We used an analytical technique called Western blotting to verify if we cultivate plants with the same genetic conformation. During the experiment, photographic documentation was taken. We found that control plants were better at cultivation according to the original protocol. On the other hand, transgenic plants showed better cultivation success in modified protocols. An optimal protocol for possible future cultivation of M. sativa has been proposed.
Klíčová slova
Somatická embryogeneze, Medicago sativa
Klíčová slova v angličtině
Somatic embryogenesis, Medicago sativa
Rozsah průvodní práce
51
Jazyk
CZ
Anotace
Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací sterilních kultivačních podmínek u Medicago sativa. M. sativa je trvalá fialově kvetoucí rostlina, která dnes roste téměř po celém světě v mnoha různých biotypech. Vojtěška se především využívá jako krmivo a podsev při pěstování obilovin, ale i jako modelový organismus pro genetické studie. Kultivace Medicago sativa probíhá pomocí metody zvané somatická embryogeneze. Je to proces, při kterém se vyvíjejí embrya ze somatických buněk. Hlavním cílem této práce byla kultivace vojtěšky skrze somatickou embryogenezi s modifikacemi ve sterilizaci listů, složení jednotlivých médií i samotné délky kultivace. V rámci experimentu byly použity jak kontrolní rostliny, tak i transgenní rostliny M. sativa. Pro ověření, zda se během propagace rostlinného materiálu produkují rostliny se stejnou genetickou úpravou, jsme využili analytickou techniku zvanou Western blot. Během experimentu byla provedena fotodokumentace, která mapuje průběh celé kultivace. Zjistili jsme, že kontrolním rostlinám se více dařilo při kultivaci podle původního protokolu. Naopak u transgenních rostlin byla větší úspěšnost kultivace zaznamenána po úpravě původního protokolu. Z výsledků byl navržen optimální protokol pro možné budoucí kultivace M. sativa.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis deals with the optimization of the sterile cultivation conditions of Medicago sativa. M. sativa is a violet blossoming plant that grows almost all over the world in many different biotypes. Alfalfa is mainly used as a feed for animals and for better productivity of grain cultivation, but also as a model organism for genetic studies. Medicago sativa is cultivated using a method called somatic embryogenesis. It is a process in which embryos develop from somatic cells. The main goal of this work was the cultivation of alfalfa through somatic embryogenesis with various modifications, for example, sterilization of leaves, composition of individual media and the length of cultivation itself. The control plant and the transgenic plant of M. sativa were used in the experiment. We used an analytical technique called Western blotting to verify if we cultivate plants with the same genetic conformation. During the experiment, photographic documentation was taken. We found that control plants were better at cultivation according to the original protocol. On the other hand, transgenic plants showed better cultivation success in modified protocols. An optimal protocol for possible future cultivation of M. sativa has been proposed.
Klíčová slova
Somatická embryogeneze, Medicago sativa
Klíčová slova v angličtině
Somatic embryogenesis, Medicago sativa
Zásady pro vypracování
1. Optimalizace povrchové sterilizace listů Medicago sativa
2. Příprava médií pro jednotlivá stádia somatické embryogeneze Medicago sativa dle protokolu
3. Optimalizace složení médií a délky kultivace
4. Obrazová dokumentace průběhu somatické embryogeneze Medicago sativa pomocí binokulární lupy
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
1. Optimalizace povrchové sterilizace listů Medicago sativa
2. Příprava médií pro jednotlivá stádia somatické embryogeneze Medicago sativa dle protokolu
3. Optimalizace složení médií a délky kultivace
4. Obrazová dokumentace průběhu somatické embryogeneze Medicago sativa pomocí binokulární lupy
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
1.KIEGERL, S. SIMKK, a Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Kinase, Is a Specific Activator of the Salt Stress-Induced MAPK, SIMK. THE PLANT CELL ONLINE [online]. 12(11), 2247-2258 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1105/tpc.12.11.2247. ISSN 10404651. Dostupné z: http://www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.12.11.2247
2. FU, Guohua, Vojislava GRBIC, Shengwu MA a Lining TIAN. Evaluation of somatic embryos of alfalfa for recombinant protein expression. Plant Cell Reports [online]. 2015, 34(2), 211-221 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1007/s00299-014-1700-x. ISSN 0721-7714. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00299-014-1700-x
3. HELLIWELL, C. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants. Methods [online]. 2003, 30(4), 289-295 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/S1046-2023(03)00036-7. ISSN 10462023. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1046202303000367
4. ZHANG, He, Qi-man HUANG a Jin SU. Development of Alfalfa (Medicago sativa L.) Regeneration System and Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation. Agricultural Sciences in China [online]. 2010, 9(2), 170-178 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/S1671-2927(09)60081-X. ISSN 16712927. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S167129270960081X
5. Matheson, S.L., Nowak, J. & MacLean, Selection of regenerative genotypes from highly productive cultivars of alfalfa, N.L. Euphytica (1990) 45: 105. doi:10.1007/BF00033277
6. SHETTY, Kalidas a Bryan D. MCKERSIE. Proline, thioproline and potassium mediated stimulation of somatic embryogenesis in alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Science [online]. 1993, 88(2), 185-193 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/0168-9452(93)90090-M. ISSN 01689452. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/016894529390090M
7. Monteiro, Mariza, Appezzato-da-Glória, Beatriz, Valarini, Maria José, Oliveira, Carlos Alberto de, & Vieira, Maria Lucia Carneiro. (2003). Plant regeneration from proroplasts of alfalfa (Medicago sativa) via somatic embryogenesis. Scientia Agricola, 60(4), 683-689. https://dx.doi.org/10.1590/S0103-9016200300040001
Seznam doporučené literatury
1.KIEGERL, S. SIMKK, a Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Kinase, Is a Specific Activator of the Salt Stress-Induced MAPK, SIMK. THE PLANT CELL ONLINE [online]. 12(11), 2247-2258 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1105/tpc.12.11.2247. ISSN 10404651. Dostupné z: http://www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.12.11.2247
2. FU, Guohua, Vojislava GRBIC, Shengwu MA a Lining TIAN. Evaluation of somatic embryos of alfalfa for recombinant protein expression. Plant Cell Reports [online]. 2015, 34(2), 211-221 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1007/s00299-014-1700-x. ISSN 0721-7714. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00299-014-1700-x
3. HELLIWELL, C. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants. Methods [online]. 2003, 30(4), 289-295 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/S1046-2023(03)00036-7. ISSN 10462023. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1046202303000367
4. ZHANG, He, Qi-man HUANG a Jin SU. Development of Alfalfa (Medicago sativa L.) Regeneration System and Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation. Agricultural Sciences in China [online]. 2010, 9(2), 170-178 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/S1671-2927(09)60081-X. ISSN 16712927. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S167129270960081X
5. Matheson, S.L., Nowak, J. & MacLean, Selection of regenerative genotypes from highly productive cultivars of alfalfa, N.L. Euphytica (1990) 45: 105. doi:10.1007/BF00033277
6. SHETTY, Kalidas a Bryan D. MCKERSIE. Proline, thioproline and potassium mediated stimulation of somatic embryogenesis in alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Science [online]. 1993, 88(2), 185-193 [cit. 2016-10-06]. DOI: 10.1016/0168-9452(93)90090-M. ISSN 01689452. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/016894529390090M
7. Monteiro, Mariza, Appezzato-da-Glória, Beatriz, Valarini, Maria José, Oliveira, Carlos Alberto de, & Vieira, Maria Lucia Carneiro. (2003). Plant regeneration from proroplasts of alfalfa (Medicago sativa) via somatic embryogenesis. Scientia Agricola, 60(4), 683-689. https://dx.doi.org/10.1590/S0103-9016200300040001
Přílohy volně vložené
1 CD ROM
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, Dr.Sc. představil studenta přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce student seznámil všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího bakalářské práce student zodpověděl uspokojivě, doložil je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Dr. Luptovčiak: Kolik SDS analýz a WB jste dělali pro MMK3 v SIMKK RNAi liniích?
Dr. Takáč: Z jaké části rostliny byl extrahovaný protein?
Dr. Kuchařová: Proč jste vynechávali ve sterilizacích ethanol?
doc. Ovečka: Sterilizace probíhala u in vivo rostlin? Pozorovali jste zásadní rozdíly v morfologii somatických embryí po snížení/zvýšení (celkem dramatickém) růstových hormonů v růstovém médiu?
prof. Šamaj: Jaký rozdíl je v transformacích u M. sativa a M. truncatula?