Informace o kvalifikační práci Molekulárně genetická charakterizace transgenních linií ječmene s modifikovanou expresí mitogenem-aktivované protein kinasy MPK4.
Pomocí molekulárních a fyziologických metod byly charakterizovány transgenní linie ječmene s umlčením genu HvMPK4 (RNAi) a transgenní linie ječmene s nadprodukcí genu HvMPK4 (nadprodukční). PCR genotypování prokázalo přítomnost kompletních T-DNA kazet u celkem osmi nezávislých transgenních RNAi linií a u celkem jedenácti transgenních nadprodukčních linií. V práci byla také ověřena spolehlivost rychlého a jednoduchého genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Pomocí Multiplex TaqMan qPCR byli v T2 generaci RNAi linií a v T1 generaci naprodukčních linií identifikovány rostliny potenciálně homozygotní v T-DNA inzercích. Spolehlivost predikce genotypů těchto jedinců byla potvrzena prokázáním uniformity jejich potomstva v hygromycinové rezistenci pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Analýza exprese pomocí RT-qPCR ukázala, že potomci pěti nezávislých RNAi linií měli v T3 generaci minimálně čtyřikrát nižší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny a, že potomci osmi nezávislých nadprodukčních linií měli v T2 generaci čtyřikrát až osmkrát větší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny. Nebyl pozorován žádný rozdíl v dynamice vadnutí nadzemní části rostliny u potomků vybraných RNAi, nadprodukčních a kontrolních linií v průběhu působení sucha.
Anotace v angličtině
Molecular and physiological methods were used for the characterization of transgenic barley lines bearing silenced HvMPK4 gene (RNAi) and of transgenic barley lines overexpressing HvMPK4 gene (overexpression). PCR genotyping confirmed presence of complete T-DNA insertions in eight independent transgenic RNAi lines and in eleven transgenic overexpression lines. In addition, reliability of the fast and easy in vitrohygromycine resistance assay for the genotyping of transgenic barley plants was confirmed. Plants potentially homozygous in T-DNA insertions were identified in T2 generation of RNAi lines as well as in T1 generation of overexpression lines by means of Multiplex TaqMan qPCR. Reliability of the genotype prediction of these individuals was confirmed by resistance of all their progenies to hygromycine as determined with in vitro hygromycine resistance assay. The RT-qPCR expression analysis showed that T3 generation progenies of five independent RNAi lines contained at minimal four times less HvMPK4 mRNA than control plants, whereas T2 generation progenies of eight independent overexpression lines contained four to eight times more HvMPK4 mRNA than control plants. No difference was observed in the shoot wilting dynamics among progenies of selected RNAi, overexpression and control lines during exposure to drought stress.
Pomocí molekulárních a fyziologických metod byly charakterizovány transgenní linie ječmene s umlčením genu HvMPK4 (RNAi) a transgenní linie ječmene s nadprodukcí genu HvMPK4 (nadprodukční). PCR genotypování prokázalo přítomnost kompletních T-DNA kazet u celkem osmi nezávislých transgenních RNAi linií a u celkem jedenácti transgenních nadprodukčních linií. V práci byla také ověřena spolehlivost rychlého a jednoduchého genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Pomocí Multiplex TaqMan qPCR byli v T2 generaci RNAi linií a v T1 generaci naprodukčních linií identifikovány rostliny potenciálně homozygotní v T-DNA inzercích. Spolehlivost predikce genotypů těchto jedinců byla potvrzena prokázáním uniformity jejich potomstva v hygromycinové rezistenci pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Analýza exprese pomocí RT-qPCR ukázala, že potomci pěti nezávislých RNAi linií měli v T3 generaci minimálně čtyřikrát nižší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny a, že potomci osmi nezávislých nadprodukčních linií měli v T2 generaci čtyřikrát až osmkrát větší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny. Nebyl pozorován žádný rozdíl v dynamice vadnutí nadzemní části rostliny u potomků vybraných RNAi, nadprodukčních a kontrolních linií v průběhu působení sucha.
Anotace v angličtině
Molecular and physiological methods were used for the characterization of transgenic barley lines bearing silenced HvMPK4 gene (RNAi) and of transgenic barley lines overexpressing HvMPK4 gene (overexpression). PCR genotyping confirmed presence of complete T-DNA insertions in eight independent transgenic RNAi lines and in eleven transgenic overexpression lines. In addition, reliability of the fast and easy in vitrohygromycine resistance assay for the genotyping of transgenic barley plants was confirmed. Plants potentially homozygous in T-DNA insertions were identified in T2 generation of RNAi lines as well as in T1 generation of overexpression lines by means of Multiplex TaqMan qPCR. Reliability of the genotype prediction of these individuals was confirmed by resistance of all their progenies to hygromycine as determined with in vitro hygromycine resistance assay. The RT-qPCR expression analysis showed that T3 generation progenies of five independent RNAi lines contained at minimal four times less HvMPK4 mRNA than control plants, whereas T2 generation progenies of eight independent overexpression lines contained four to eight times more HvMPK4 mRNA than control plants. No difference was observed in the shoot wilting dynamics among progenies of selected RNAi, overexpression and control lines during exposure to drought stress.
1) Příprava literární rešerše na téma mitogenem aktivované proteinkinasy jednoděložných a dvouděložných rostlin a molekulárně genetická charakterizace transgenních rostlin
2) Preselekce transgenních linií ječmene odrůdy Golden Promise se zvýšenou expresí HvMPK4 genu a s umlčeným HvMPK4 genem (RNA interference) pro vlastní experimenty na základě genotypování rostlin a stanovení počtu kopií transgenů. K tomuto účelu budou využity molekulární (PCR, Multiplex TaqMan qPCR, RT-qPCR) a genetické metody (statistická verifikace segregace transgenů). Dílčím cílem práce bude také ověření spolehlivosti genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro provokačního testu hygromycinové rezistence.
3) Kondicionální fenotypování vybraných transgenních linií ječmene v podmínkách působení vodního stresu. Klíční rostliny vybraných transgenních linií ječmene budou vystaveny nedostatku vody a v časové řadě bude pozorována a vyhodnocena rychlost jejich vadnutí ve srovnání s netransgenní kontrolou. Bude také analyzována dynamika ztráty vody u transgenních a kontrolních rostlin pomocí vážení rostlin v časové řadě po jejich saturaci vodou.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
1) Příprava literární rešerše na téma mitogenem aktivované proteinkinasy jednoděložných a dvouděložných rostlin a molekulárně genetická charakterizace transgenních rostlin
2) Preselekce transgenních linií ječmene odrůdy Golden Promise se zvýšenou expresí HvMPK4 genu a s umlčeným HvMPK4 genem (RNA interference) pro vlastní experimenty na základě genotypování rostlin a stanovení počtu kopií transgenů. K tomuto účelu budou využity molekulární (PCR, Multiplex TaqMan qPCR, RT-qPCR) a genetické metody (statistická verifikace segregace transgenů). Dílčím cílem práce bude také ověření spolehlivosti genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro provokačního testu hygromycinové rezistence.
3) Kondicionální fenotypování vybraných transgenních linií ječmene v podmínkách působení vodního stresu. Klíční rostliny vybraných transgenních linií ječmene budou vystaveny nedostatku vody a v časové řadě bude pozorována a vyhodnocena rychlost jejich vadnutí ve srovnání s netransgenní kontrolou. Bude také analyzována dynamika ztráty vody u transgenních a kontrolních rostlin pomocí vážení rostlin v časové řadě po jejich saturaci vodou.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
1. Bubner, B., Baldwin, I.T. Use of real-time PCR for determining copy number and zygosity in transgenic plants. (2004). Plant Cell Rep. 23, 263-71.
2. Colcombet, J., and Hirt, H. (2008). Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochemical Journal 413, 217-226.
3. Danquah, A., Zelicourt, A., Colcombet, J., Hirt, H. (2014). The role of ABA and MAPK signaling pathways in plant abiotic stress responses. Biotechnology Advances 32(1), 40-52.
4. Fletcher, S.J. qPCR for quantification of transgene expression and determination of transgene copy number. (2014). Methods Mol Biol. 1145, 213-37.
5. Gadaleta, A., Giancaspro, A., Cardone, M.F., Blanco, A. Real-time PCR for the detection of precise transgene copy number in durum wheat. (2011). Cell Mol Biol Lett.16, 652-68.
6. Golldack, D., Li, C., Mohan H., Probst, N. (2014). Tolerance to drought and salt stress in plants: unraveling the signaling networks. Frontiers in Plant Science, 5, 151.
7. Mahajan, S., Tuteja N. (2005). Cold, salinity and drought stresses: An overview. Archives of Biochemistry and Biophysics 444, 139158
8. Opdenakker, K. Remans, T. Vangronsveld, J. Cuypers, A. (2012). Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinases in Plant Metal Stress: Regulation and Responses in Comparison to Other Biotic and Abiotic Stresses. Int J Mol Sci 13, 7828-7853.
9. Ovečka, M., Takáč, T., Komis, G., Vadovič, P., Bekešová, S., Doskočilová, A., Smékalová, V., Luptovčiak, I., Šamajová, O. , Schweighofer, A., Meskiene, I., Jonak, C., Křenek, P.,Lichtscheidl, I., Skultety, L., Hirt, H., Šamaj, J. Salt-induced subcellular kinase relocation and seeding susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. (2014). Journal of Experimental Botany 65(9), 2335-2350.
10. Pitzschke, A. (2014). Modes of MAPK substrate recognition and control. Trends in Plant Science. In press. DOI: 10.1016/j.tplants.2014.09.006
11. Schmittgen, T. D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. (2008). Nature Protocols 3, 1101 1108.
12. Sinha, A.K., Jaggi, M., Raghuram, B., Tuteja, N. (2011). Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress. Plant Signal Behav 6, 196203.
13. Smékalová, V., Doskočilová, A., Komis, G., Šamaj, J. Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. (2014). Biotechnology Advances 32(1), 2-11.
14. Šamajová, O., Plíhal, O., Al-Yousif, M., Hirt, H., Šamaj, J. (2013) Improvement of stress tolerance in plants by genetic manipulation of mitogen-activated protein kinases. Biotechnology Advances 31(1), 118-128.
15. Xiong, L., and Yang, Y. (2003). Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase. Plant Cell 15, 745-759.
16. Xu, J., Xie, J., Yan, C., Zou, X., Ren, D., Zhang, S. A chemical genetic approach demonstrates that MPK3/MPK6 activation and NADPH oxidase-mediated oxidative burst are two independent signaling events in plant immunity. (2014). Plant Journal 77(2), 222-34.
17. Zhuang, J., Zhang, J., Hou, X.L., Wang F., Xiong A.S. Transcriptomic, proteomic, metabolomic and functional genomic approaches for the study of abiotic stress in vegetable crops. (2014). Critical Reviews in Plant Sciences 33, 225237.
Seznam doporučené literatury
1. Bubner, B., Baldwin, I.T. Use of real-time PCR for determining copy number and zygosity in transgenic plants. (2004). Plant Cell Rep. 23, 263-71.
2. Colcombet, J., and Hirt, H. (2008). Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochemical Journal 413, 217-226.
3. Danquah, A., Zelicourt, A., Colcombet, J., Hirt, H. (2014). The role of ABA and MAPK signaling pathways in plant abiotic stress responses. Biotechnology Advances 32(1), 40-52.
4. Fletcher, S.J. qPCR for quantification of transgene expression and determination of transgene copy number. (2014). Methods Mol Biol. 1145, 213-37.
5. Gadaleta, A., Giancaspro, A., Cardone, M.F., Blanco, A. Real-time PCR for the detection of precise transgene copy number in durum wheat. (2011). Cell Mol Biol Lett.16, 652-68.
6. Golldack, D., Li, C., Mohan H., Probst, N. (2014). Tolerance to drought and salt stress in plants: unraveling the signaling networks. Frontiers in Plant Science, 5, 151.
7. Mahajan, S., Tuteja N. (2005). Cold, salinity and drought stresses: An overview. Archives of Biochemistry and Biophysics 444, 139158
8. Opdenakker, K. Remans, T. Vangronsveld, J. Cuypers, A. (2012). Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinases in Plant Metal Stress: Regulation and Responses in Comparison to Other Biotic and Abiotic Stresses. Int J Mol Sci 13, 7828-7853.
9. Ovečka, M., Takáč, T., Komis, G., Vadovič, P., Bekešová, S., Doskočilová, A., Smékalová, V., Luptovčiak, I., Šamajová, O. , Schweighofer, A., Meskiene, I., Jonak, C., Křenek, P.,Lichtscheidl, I., Skultety, L., Hirt, H., Šamaj, J. Salt-induced subcellular kinase relocation and seeding susceptibility caused by overexpression of Medicago SIMKK in Arabidopsis. (2014). Journal of Experimental Botany 65(9), 2335-2350.
10. Pitzschke, A. (2014). Modes of MAPK substrate recognition and control. Trends in Plant Science. In press. DOI: 10.1016/j.tplants.2014.09.006
11. Schmittgen, T. D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. (2008). Nature Protocols 3, 1101 1108.
12. Sinha, A.K., Jaggi, M., Raghuram, B., Tuteja, N. (2011). Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress. Plant Signal Behav 6, 196203.
13. Smékalová, V., Doskočilová, A., Komis, G., Šamaj, J. Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. (2014). Biotechnology Advances 32(1), 2-11.
14. Šamajová, O., Plíhal, O., Al-Yousif, M., Hirt, H., Šamaj, J. (2013) Improvement of stress tolerance in plants by genetic manipulation of mitogen-activated protein kinases. Biotechnology Advances 31(1), 118-128.
15. Xiong, L., and Yang, Y. (2003). Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase. Plant Cell 15, 745-759.
16. Xu, J., Xie, J., Yan, C., Zou, X., Ren, D., Zhang, S. A chemical genetic approach demonstrates that MPK3/MPK6 activation and NADPH oxidase-mediated oxidative burst are two independent signaling events in plant immunity. (2014). Plant Journal 77(2), 222-34.
17. Zhuang, J., Zhang, J., Hou, X.L., Wang F., Xiong A.S. Transcriptomic, proteomic, metabolomic and functional genomic approaches for the study of abiotic stress in vegetable crops. (2014). Critical Reviews in Plant Sciences 33, 225237.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby:
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, Dr.Sc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího bakalářské práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Dr. Takáč:
Vyjádřil nesouhlas s oponentem, že grafická úroveň obrázků je nízká. Zároveň zohlednil, v reakci na výtku oponenta, že jazyková bariéra studentky byla v psaní práce v českém jazyce velmi obstojně překonaná, a studentku v tomto směru naopak podpořil.
Proč jste si vybrali sucho jako stresový faktor? Máte i jiný návrh na stresové faktory, které by šly použít?