Tato bakalářská práce je zaměřena na studium funkce mitogen-aktivované proteinkinasy 3 (MPK3) při vývoji Arabidopsis thaliana pomocí mutanta prezentovaného jako T-DNA inzerční mutant s nefunkčním genem MPK3. MPK3 patří k nejlépe charakterizovaným mitogen-aktivovaným proteinkinasam (MAPK), jež hrají významnou úlohu při buněčné signalizaci a podílejí se na rostlinné odpovědi vůči nejrůznějším typům abiotického a biotického stresu. Konkrétně MPK3 jsou součástí signálních drah vznikajících při působení těžkých kovů, v přítomnosti reaktivních kyslíkových radikálů, při osmotickém stresu nebo stresu vyvolaném různými patogeny. Hlavními cíli této práce byla genotypizace mutantních rostlin Arabidopsis thaliana mpk3-4/2, dále fenotypová analýza kořene a nadzemní části mutanta mpk3-4/2, která byla zaměřena na velikost semen, vzdálenost od kořenové špičky po první kořenový vlásek, délka hlavního kořene, velikost průduchů a rozdíly ve větvení trichomů a nakonec ověření absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mutanta mpk3-4/2. Při genotypizaci metodou PCR byly identifikovány homozygotní rostliny mpk3-4/2 pomocí speciálně navržených primerů. Další generace těchto rostlin byla podrobena fenotypové analýze, při které však mutantní rostliny vykazovaly velmi podobný fenotyp jako kontrolní rostliny Col-0. Nebyly pozorovány žádné výrazné rozdíly. Nakonec byla ověřována absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mpk3-4/2 pomocí metody Western blot a bylo zjištěno, že ve všech liniích T-DNA inzerčního mutanta mpk3-4/2 je však protein MPK3 přítomen. Patrně proto nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi fenotypem mutanta mpk3-4/2 a kontrolními rostlinami.
Annotation in English
This bachelor thesis is focused on study of mitogen-activated protein kinase 3 (MPK3) function during a development of Arabidopsis thaliana using mutant presented as T-DNA insertion mutant with nonfunctional MPK3 gene. MPK3 belongs to the best characterized mitogen-activated protein kinases (MAPKs) which play an important role during cell signaling and they are involved in the plant response to diverse types of abiotic and biotic stresses. Specifically, MPK3 participates in the signal pathways emerging during heavy metal stress, in presence of reactive oxygen species, during osmotic stress or stress caused by various pathogens. Genotyping of Arabidopsis thaliana mpk3-4/2 mutant plants, then phenotypic analysis of root and aboveground part of mpk3-4/2 mutant focused on seed size, distance from root tip to first visible root hair, main root length, stomata size and differences in trichome branching and finally verification of MPK3 protein absence in homozygous plants of mpk3-4/2 were the main goals of this thesis. Homozygous plants of mpk3-4/2 were identified by PCR using specially designed primers. Next generation of these plants were subjected to phenotypic analysis, but mutant plants have showed very similar phenotype as wild type plants. No significant differences were observed. Finally, absence of MPK3 protein was verified by Western blot in homozygous plants of mpk3-4/2 and the results proved the presence of MPK3 in all T-DNA insertion mutant lines. Probably this is the reason why no differences between phenotype of mpk3-4/2 mutant plants and the wild type plants were observed.
Mitogen-activated protein kinase, Arabidopsis thaliana, MPK3, abiotic and biotic stress
Length of the covering note
56 s.
Language
CZ
Annotation
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium funkce mitogen-aktivované proteinkinasy 3 (MPK3) při vývoji Arabidopsis thaliana pomocí mutanta prezentovaného jako T-DNA inzerční mutant s nefunkčním genem MPK3. MPK3 patří k nejlépe charakterizovaným mitogen-aktivovaným proteinkinasam (MAPK), jež hrají významnou úlohu při buněčné signalizaci a podílejí se na rostlinné odpovědi vůči nejrůznějším typům abiotického a biotického stresu. Konkrétně MPK3 jsou součástí signálních drah vznikajících při působení těžkých kovů, v přítomnosti reaktivních kyslíkových radikálů, při osmotickém stresu nebo stresu vyvolaném různými patogeny. Hlavními cíli této práce byla genotypizace mutantních rostlin Arabidopsis thaliana mpk3-4/2, dále fenotypová analýza kořene a nadzemní části mutanta mpk3-4/2, která byla zaměřena na velikost semen, vzdálenost od kořenové špičky po první kořenový vlásek, délka hlavního kořene, velikost průduchů a rozdíly ve větvení trichomů a nakonec ověření absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mutanta mpk3-4/2. Při genotypizaci metodou PCR byly identifikovány homozygotní rostliny mpk3-4/2 pomocí speciálně navržených primerů. Další generace těchto rostlin byla podrobena fenotypové analýze, při které však mutantní rostliny vykazovaly velmi podobný fenotyp jako kontrolní rostliny Col-0. Nebyly pozorovány žádné výrazné rozdíly. Nakonec byla ověřována absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mpk3-4/2 pomocí metody Western blot a bylo zjištěno, že ve všech liniích T-DNA inzerčního mutanta mpk3-4/2 je však protein MPK3 přítomen. Patrně proto nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi fenotypem mutanta mpk3-4/2 a kontrolními rostlinami.
Annotation in English
This bachelor thesis is focused on study of mitogen-activated protein kinase 3 (MPK3) function during a development of Arabidopsis thaliana using mutant presented as T-DNA insertion mutant with nonfunctional MPK3 gene. MPK3 belongs to the best characterized mitogen-activated protein kinases (MAPKs) which play an important role during cell signaling and they are involved in the plant response to diverse types of abiotic and biotic stresses. Specifically, MPK3 participates in the signal pathways emerging during heavy metal stress, in presence of reactive oxygen species, during osmotic stress or stress caused by various pathogens. Genotyping of Arabidopsis thaliana mpk3-4/2 mutant plants, then phenotypic analysis of root and aboveground part of mpk3-4/2 mutant focused on seed size, distance from root tip to first visible root hair, main root length, stomata size and differences in trichome branching and finally verification of MPK3 protein absence in homozygous plants of mpk3-4/2 were the main goals of this thesis. Homozygous plants of mpk3-4/2 were identified by PCR using specially designed primers. Next generation of these plants were subjected to phenotypic analysis, but mutant plants have showed very similar phenotype as wild type plants. No significant differences were observed. Finally, absence of MPK3 protein was verified by Western blot in homozygous plants of mpk3-4/2 and the results proved the presence of MPK3 in all T-DNA insertion mutant lines. Probably this is the reason why no differences between phenotype of mpk3-4/2 mutant plants and the wild type plants were observed.
Mitogen-activated protein kinase, Arabidopsis thaliana, MPK3, abiotic and biotic stress
Research Plan
1) Zpracování literární rešerše na téma signalizace mitogen-aktivovaných proteinkinas (MAPKs) se zaměřením na MPK3
2) Fenotypová charakterizace kořene a nadzemní části mutanta A. thaliana mpk3-4/2
3) Určení homozygotních rostlin mutanta mpk3-4/2 pomocí genotypizace
4) Ověření absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mutanta mpk3-4/2 pomocí western blotu
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Research Plan
1) Zpracování literární rešerše na téma signalizace mitogen-aktivovaných proteinkinas (MAPKs) se zaměřením na MPK3
2) Fenotypová charakterizace kořene a nadzemní části mutanta A. thaliana mpk3-4/2
3) Určení homozygotních rostlin mutanta mpk3-4/2 pomocí genotypizace
4) Ověření absence proteinu MPK3 v homozygotních rostlinách mutanta mpk3-4/2 pomocí western blotu
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Oddělení buněčné biologie CRH ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu na webové stránce Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Recommended resources
1) Colcombet J, Hirt H (2008) Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochem. J. 413: 217226. doi:10.1042/BJ20080625.
2) Rentel MC, Lecourieux D, Ouaked F, Usher SL, Petersen L, Okamoto H, Knight H, Peck SC, Grierson CS, Hirt H, Knight MR (2004) OXI1 kinase is necessary for oxidative burst-mediated signalling in Arabidopsis. Nature. 427: 858-861.
3) Sinha AK, Jaggi M, Raghuram B, Tuteja N (2011) Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress. Plant Signal Behav. 6: 196-203. 4) Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Samaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnol. Adv. 32: 2-11. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.07.009.
5) Smékalová V, Luptovčiak I, Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Doskočilová A, Takáč T, Vadovič P, Novák O, Pechan T, Ziemann A, Košútová P, Šamaj J (2014) Involvement of YODA and mitogen activated protein kinase 6 in Arabidopsis post-embryogenic root development through auxin up-regulation and cell division plane orientation. New Phytol. 203: 1175-1793. doi: 10.1111/nph.12880.
6) Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends Plant Sci. 18: 140-148. doi: 10.1016/j.tplants.2012.11.004.
7) Wang H, Ngwenyama N, Liu Y, Walker JC, Zhang S (2007) Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19: 63-73.
Recommended resources
1) Colcombet J, Hirt H (2008) Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved in multiple biological processes. Biochem. J. 413: 217226. doi:10.1042/BJ20080625.
2) Rentel MC, Lecourieux D, Ouaked F, Usher SL, Petersen L, Okamoto H, Knight H, Peck SC, Grierson CS, Hirt H, Knight MR (2004) OXI1 kinase is necessary for oxidative burst-mediated signalling in Arabidopsis. Nature. 427: 858-861.
3) Sinha AK, Jaggi M, Raghuram B, Tuteja N (2011) Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress. Plant Signal Behav. 6: 196-203. 4) Smékalová V, Doskočilová A, Komis G, Samaj J (2014) Crosstalk between secondary messengers, hormones and MAPK modules during abiotic stress signalling in plants. Biotechnol. Adv. 32: 2-11. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.07.009.
5) Smékalová V, Luptovčiak I, Komis G, Šamajová O, Ovečka M, Doskočilová A, Takáč T, Vadovič P, Novák O, Pechan T, Ziemann A, Košútová P, Šamaj J (2014) Involvement of YODA and mitogen activated protein kinase 6 in Arabidopsis post-embryogenic root development through auxin up-regulation and cell division plane orientation. New Phytol. 203: 1175-1793. doi: 10.1111/nph.12880.
6) Šamajová O, Komis G, Šamaj J (2013) Emerging topics in the cell biology of mitogen-activated protein kinases. Trends Plant Sci. 18: 140-148. doi: 10.1016/j.tplants.2012.11.004.
7) Wang H, Ngwenyama N, Liu Y, Walker JC, Zhang S (2007) Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19: 63-73.
Enclosed appendices
-
Appendices bound in thesis
-
Taken from the library
Yes
Full text of the thesis
Appendices
Reviewer's report
Supervisor's report
Defence procedure record
V úvodu obhajoby předseda komise prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc. představil studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě v prezentaci a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Prof. Šamaj: Jakým způsobem je možné kromě abundance proteinu charakterizovat výsledek mutace konkrétního genu pro MAPK?
Dr. Šamajová: V jakých podmínkách rostly rostliny, u kterých byla prováděna fenotypová analýza?
Dr. Takáč: Kromě genetických a biochemických analýz, byla provedena i analýza fosforylace a aktivace MPK3 proteinu u mpk3-4/2 mutanta?
Dr. Křenek: Jakým způsobem by bylo možné vysvětlit pozorované fenotypové znaky mpk3-1 mutanta?
Dr. Zapletalová: Může studentka vysvětlit, proč byla metoda Western Blot prováděna až po fenotypové analýze?