Včely se řadí mezi hospodářsky velmi významné opylovatele, proto ztráty včelstev jsou velmi znepokojivým trendem. Aby škody, které včelaři a zemědělci za poslední léta zaznamenali, byly co nejmenší, je třeba dále studovat imunitní systém včel, což by mohlo vést k aplikaci poznatků základního výzkumu do praxe. V teoretické části bakalářské práce je shrnut imunitní systém včel (Apis mellifera). Imunitní systém jednotlivých včel se skládá z 1) fyzikálních bariér, 2) buněčné imunity, 3) humorální imunity. Nejen patogeny či paraziti, ale také oxidační stres způsobený mnoha faktory, mají přímý dopad na zdraví včel. Ke snižování oxidačního stresu mají organismy vyvinuté obranné mechanismy, jejichž součástí jsou i antioxidační enzymy katalasa a superoxiddismutasa. K humorální imunitě také patří antimikrobiální peptidy, v hemolymfě včel jsou obsaženy známé antimikrobiální peptidy apidaeciny, abaecin, defensiny a hymenoptaecin.
V praktické části byla spektrofotometricky stanovena specifická aktivita enzymu katalasy jak u klinicky zdravých včel odebraných přímo ze včelstev, tak u včel krmených v in vitro podmínkách potravou obsahující 50% sacharosu, 50% sacharosu a pyl a také potravu obohacenou o přirozené včelí patogeny Paenibacillus larvae a Ascosphaera apis. Ve vzorcích včel krmených in vitro byla hodnota specifické aktivity katalasy nejvyšší v případě, že potrava obsahovala 50% sacharosu s pylem. U včel, které byly odebrány přímo ze včelstev, se hodnoty specifické aktivity katalasy lišily pouze v homogenizovaných zadečcích v rámci včelstva 23 mezi porovnávanými odběrovými měsíci.
Pro detekci antimikrobiálních peptidů v hemolymfě, byla optimalizována metoda gelové elektroforézy a následná imunodetekce antimikrobiálních peptidů abaecinu a defensinu1 metodou Western blot. Pro vizualizaci proteinů na gelech bylo optimální barvení koloidním Coomassie Brilliant Blue-G250. Antimikrobiální peptidy detekované metodou Western blot byly nejlépe vizualizované na nitrocelulosové membráně blokované roztokem 5% BSA. Celý postup je ovšem potřeba dále optimalizovat.
Anotace v angličtině
Honey bees are very important pollinators and so the decline of bee colonies is alarming. To minimalize the demage caused to beekeepers and farmers in the last years it is necessary to proceed with research of bee immune system, which could lead to the application of the basic research results into the practice. The theoretical part of the bachelor's thesis describes the immune system of honey bees (Apis mellifera). The immune system of a bee consists of 1) physical barriers, 2) cellular immunity, 3) humoral immunity. Not only pathogenes or parasites, but also oxidative stress caused by many factors, have direct influence on health of bees. The organisms develop protective mechanisms to reduce oxidative stress, which include also antioxidative enzymes catalase and superoxide dismutase. The humoral immunity incorporates also antimicrobial peptides, the well-known antimicrobial peptides of haemolymph are apidaecins, abaecin, defensin and hymeoptaecin.
In the practical part of the bachelor's thesis the specific activity of enzyme catalase was determined by spectrophotometry, as of clinically healthy honey bees taken directly from the bee colonies, as of the in vitro honey bees feeded by the nourishment containing 50% of sucrose, 50% of sucrose with pollen and also by nourishment enriched with natural bee's pathogens Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. In the speciments of bees nourished in vitro was the highest figure of specific activity of catalase in the cases nourished by 50% of sucrose with pollen. The levels of catalase specific activity of the bees taken directly from the bee colonies were diferent only in homogenized bee abdomens in the bee colony 23 between compared months.
The method of gel electrophoresis was optimalized and subsequent imunodetection of antimicrobial peptides abaecin and defensin 1 by the Western blot method to detect antimicrobial peptides in haemolymph. To make the proteins within the gels visible the staining with coloid Coomassie Brilliant Nlue-G250 was optimal. Antimicrobial peptides detected by the Western blot method were preferebly visualized on nitrocellulose membrane blocked by 5% solution of BSA. It will be necessary to further optimalize the whole procedure.
Včely se řadí mezi hospodářsky velmi významné opylovatele, proto ztráty včelstev jsou velmi znepokojivým trendem. Aby škody, které včelaři a zemědělci za poslední léta zaznamenali, byly co nejmenší, je třeba dále studovat imunitní systém včel, což by mohlo vést k aplikaci poznatků základního výzkumu do praxe. V teoretické části bakalářské práce je shrnut imunitní systém včel (Apis mellifera). Imunitní systém jednotlivých včel se skládá z 1) fyzikálních bariér, 2) buněčné imunity, 3) humorální imunity. Nejen patogeny či paraziti, ale také oxidační stres způsobený mnoha faktory, mají přímý dopad na zdraví včel. Ke snižování oxidačního stresu mají organismy vyvinuté obranné mechanismy, jejichž součástí jsou i antioxidační enzymy katalasa a superoxiddismutasa. K humorální imunitě také patří antimikrobiální peptidy, v hemolymfě včel jsou obsaženy známé antimikrobiální peptidy apidaeciny, abaecin, defensiny a hymenoptaecin.
V praktické části byla spektrofotometricky stanovena specifická aktivita enzymu katalasy jak u klinicky zdravých včel odebraných přímo ze včelstev, tak u včel krmených v in vitro podmínkách potravou obsahující 50% sacharosu, 50% sacharosu a pyl a také potravu obohacenou o přirozené včelí patogeny Paenibacillus larvae a Ascosphaera apis. Ve vzorcích včel krmených in vitro byla hodnota specifické aktivity katalasy nejvyšší v případě, že potrava obsahovala 50% sacharosu s pylem. U včel, které byly odebrány přímo ze včelstev, se hodnoty specifické aktivity katalasy lišily pouze v homogenizovaných zadečcích v rámci včelstva 23 mezi porovnávanými odběrovými měsíci.
Pro detekci antimikrobiálních peptidů v hemolymfě, byla optimalizována metoda gelové elektroforézy a následná imunodetekce antimikrobiálních peptidů abaecinu a defensinu1 metodou Western blot. Pro vizualizaci proteinů na gelech bylo optimální barvení koloidním Coomassie Brilliant Blue-G250. Antimikrobiální peptidy detekované metodou Western blot byly nejlépe vizualizované na nitrocelulosové membráně blokované roztokem 5% BSA. Celý postup je ovšem potřeba dále optimalizovat.
Anotace v angličtině
Honey bees are very important pollinators and so the decline of bee colonies is alarming. To minimalize the demage caused to beekeepers and farmers in the last years it is necessary to proceed with research of bee immune system, which could lead to the application of the basic research results into the practice. The theoretical part of the bachelor's thesis describes the immune system of honey bees (Apis mellifera). The immune system of a bee consists of 1) physical barriers, 2) cellular immunity, 3) humoral immunity. Not only pathogenes or parasites, but also oxidative stress caused by many factors, have direct influence on health of bees. The organisms develop protective mechanisms to reduce oxidative stress, which include also antioxidative enzymes catalase and superoxide dismutase. The humoral immunity incorporates also antimicrobial peptides, the well-known antimicrobial peptides of haemolymph are apidaecins, abaecin, defensin and hymeoptaecin.
In the practical part of the bachelor's thesis the specific activity of enzyme catalase was determined by spectrophotometry, as of clinically healthy honey bees taken directly from the bee colonies, as of the in vitro honey bees feeded by the nourishment containing 50% of sucrose, 50% of sucrose with pollen and also by nourishment enriched with natural bee's pathogens Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. In the speciments of bees nourished in vitro was the highest figure of specific activity of catalase in the cases nourished by 50% of sucrose with pollen. The levels of catalase specific activity of the bees taken directly from the bee colonies were diferent only in homogenized bee abdomens in the bee colony 23 between compared months.
The method of gel electrophoresis was optimalized and subsequent imunodetection of antimicrobial peptides abaecin and defensin 1 by the Western blot method to detect antimicrobial peptides in haemolymph. To make the proteins within the gels visible the staining with coloid Coomassie Brilliant Nlue-G250 was optimal. Antimicrobial peptides detected by the Western blot method were preferebly visualized on nitrocellulose membrane blocked by 5% solution of BSA. It will be necessary to further optimalize the whole procedure.
- Vypracovat rešerši na téma signálních drah a regulace exprese a hladiny komponent humorální složky imunitního systému hmyzu se zaměřením na včelu medonosnou, včetně přehledu metod analýzy složek humorální imunity včel
- Optimalizace metod detekce antimikrobiálních peptidů elektroforetickými a imunochemickými metodami
- Analýza vybraných fyziologických a biochemických parametrů na vzorcích včel odebraných v různou roční dobu
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
- Vypracovat rešerši na téma signálních drah a regulace exprese a hladiny komponent humorální složky imunitního systému hmyzu se zaměřením na včelu medonosnou, včetně přehledu metod analýzy složek humorální imunity včel
- Optimalizace metod detekce antimikrobiálních peptidů elektroforetickými a imunochemickými metodami
- Analýza vybraných fyziologických a biochemických parametrů na vzorcích včel odebraných v různou roční dobu
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
1) Danihlík J, Aronstein K, Petřivalský M. (2015) Antimicrobial peptides: a key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research 54(2): 123-136
2) Danihlík J., Šebela M., Petřivalský M.,Lenobel R. (2014) A sensitive quantification of the peptide apidaecin 1 isoforms in single bee tissues using a weak cation exchange pre-separation and nanocapillary liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1374, 134-144, 10.1016/j.chroma.2014.11.041
3) Randolt K., Gimple O., Geissendorfer J., Reinders J., Prusko C., Mueller M., Albert S., Tautz J.,Beier H. (2008) Immune-related proteins induced in the hemolymph after aseptic and septic injury differ in honey bee worker larvae and adults. Arch. Insect Biochem. Physiol. 69, 155 - 167, 10.1002/arch.20269
4) Klaudiny J., Bachanova K., Kohutova L., Dzurova M., Kopernicky J.,Majtan J. (2012) Expression of larval jelly antimicrobial peptide defensin1 in Apis mellifera colonies. Biologia 67, 200-211, 10.2478/s11756-011-0153-8
5) Ilyasov R. A., Gaifullina L. R., Saltykova E. S., Poskryakov A. V.,Nikolenko A. G. (2012) REVIEW OF THE EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE DEFENSIN IN HONEY BEES APIS MELLIFERA L. J. Apic. Sci. 56, 115-124, 10.2478/v10289-012-0013-y
Seznam doporučené literatury
1) Danihlík J, Aronstein K, Petřivalský M. (2015) Antimicrobial peptides: a key component of honey bee innate immunity. Journal of Apicultural Research 54(2): 123-136
2) Danihlík J., Šebela M., Petřivalský M.,Lenobel R. (2014) A sensitive quantification of the peptide apidaecin 1 isoforms in single bee tissues using a weak cation exchange pre-separation and nanocapillary liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1374, 134-144, 10.1016/j.chroma.2014.11.041
3) Randolt K., Gimple O., Geissendorfer J., Reinders J., Prusko C., Mueller M., Albert S., Tautz J.,Beier H. (2008) Immune-related proteins induced in the hemolymph after aseptic and septic injury differ in honey bee worker larvae and adults. Arch. Insect Biochem. Physiol. 69, 155 - 167, 10.1002/arch.20269
4) Klaudiny J., Bachanova K., Kohutova L., Dzurova M., Kopernicky J.,Majtan J. (2012) Expression of larval jelly antimicrobial peptide defensin1 in Apis mellifera colonies. Biologia 67, 200-211, 10.2478/s11756-011-0153-8
5) Ilyasov R. A., Gaifullina L. R., Saltykova E. S., Poskryakov A. V.,Nikolenko A. G. (2012) REVIEW OF THE EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE DEFENSIN IN HONEY BEES APIS MELLIFERA L. J. Apic. Sci. 56, 115-124, 10.2478/v10289-012-0013-y
Přílohy volně vložené
1 CD ROM
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
Dr. Kopečný: Co je principem stanovení měření aktivity katalasy? U těch výsledků z blotování bych očekával lepší výsledek u blokace mlékem, mohla byste nějak vysvětlit, proč Vám vychází lépe blokace mlékem?
Dr. Zalabák: Jak se peptidy syntetizují? Jsou to ribozomální peptidy?